抗谷胱甘肽還原酶單克隆抗體的研制及鑒定

1、    抗谷胱甘肽還原酶單克隆抗體的研制及鑒定        谷胱甘肽還原酶（EC1.6.4.2,GR）為一種黃素酶，可催化氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)變成還原型谷胱甘肽（GSH），從而提高細(xì)胞液中GSH的含量。GSH具有抵抗自由基氧化對(duì)機(jī)體損傷的作用。GSH的儲(chǔ)量與創(chuàng)傷、腫瘤等的預(yù)后，以及人體衰老有關(guān)1。本研究采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制了抗酵母菌GR的單克隆抗體（mAb），并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了分析，從而為GR的純化及其用免疫化學(xué)法測(cè)定提供了重要的試劑。1材料和方法1.1材料酵母菌谷

2、胱甘肽還原酶，為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。Balb/c小鼠，8周12周齡，雌性，體重20g左右；Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，均由鄭州博賽生物技術(shù)研究所提供。1.2方法1.2.1雜交瘤細(xì)胞系的建立動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合及克隆化，以及mAb腹水的制備，均按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)進(jìn)行。1.2.2mAb的特性鑒定效價(jià)測(cè)定：采用間接ELISA法。Ig類及亞類的鑒定：采用免疫雙擴(kuò)散法。表位分析：采用Friquet2報(bào)道的相加試驗(yàn)。特異性分析：交叉反應(yīng)試驗(yàn)：分別以GR，IgG,IgA,BSA和GSH?Px作為包被抗原，加入抗GR的mAb做間接ELISA法。阻斷試驗(yàn)：將102稀釋的mAb與0.58g/L的酵母菌或等量的正常人血

3、清混合后，置于37孵育30min再4過夜，離心（3000r/min，30min）,取上清，加入到以GR抗原包被的酶聯(lián)板中做ELISA，于波長(zhǎng)450nm測(cè)定A值。1.2.3人紅細(xì)胞中GR的測(cè)定采用免疫金銀染色法3。取膠體金標(biāo)記的抗GRmAbA11，A7，分別用TBS做2倍系列稀釋（110,1201100）制備新鮮的血涂片標(biāo)本，并經(jīng)甲醇固定5min。將上述膠體金標(biāo)記的mAb滴加在玻片上，37孵育30min，洗滌5次，用銀染色液復(fù)染10min，涼干，置光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1雜交瘤細(xì)胞的建立經(jīng)1次細(xì)胞融合后，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗GRmAb的雜交瘤細(xì)胞，命名為A11和A7。2.2mAb的特性

4、鑒定效價(jià)：以2株雜交瘤細(xì)胞（A11和A7）制備的小鼠腹水中，mAb的效價(jià)分別為0.64×105和1.28×105。Ig亞類：免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果顯示，2株mAb均為IgG1。表位分析：相加試驗(yàn)的結(jié)果表明，mAbA11和B7可識(shí)別同一抗原表位。特異性：交叉反應(yīng)試驗(yàn)中，2株mAb均可同GR起反應(yīng)，而同IgG，IgA,BSA和GSH-Px均無反應(yīng)性?？乖钄嘣囼?yàn)中，2株mAb經(jīng)用GR和正常人血清吸收后，A值明顯下降，表明所獲2株mAb都是針對(duì)GR的特異性抗體。2.3人紅細(xì)胞中GR的表達(dá)免疫金銀染色法檢測(cè)表明，在滴加2×101102膠體金標(biāo)記的mAb的標(biāo)本中，鏡下可見紅細(xì)

5、胞內(nèi)具有黑褐色的金屬銀顆粒，而在對(duì)照標(biāo)本中則呈陰性（1，2）。1免疫金銀染色法檢測(cè)人紅細(xì)胞中GR的表達(dá)（加抗GRmAb）(×1000)2免疫金銀染色法檢測(cè)人紅細(xì)胞中GR的表達(dá)(未加抗GRmAb)(×1000)3討論GR的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為100000，是由兩條Mr相同的肽鏈組成的二聚體。GR可從人紅細(xì)胞中提取4，但方法繁鎖，產(chǎn)量過低，不易純化。本文中我們采用酵母菌GR為免疫原制備抗GR的mAb，通過1次融合，即獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗GRmAb的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)及反復(fù)凍存、復(fù)蘇，其分泌特異性mAb的能力不變。除酵母菌GR對(duì)mAb有明顯的阻斷作用外，正常人血清對(duì)m

6、Ab也有阻斷效應(yīng)，說明酵母菌GR與人的GR具有同源性。特別是應(yīng)用膠體金標(biāo)記的mAb證實(shí)，其與人紅細(xì)胞內(nèi)的GR可起反應(yīng)，表明應(yīng)用酵母菌GR為免疫原研制的抗GRmAb可用于人GR的檢測(cè)，也可進(jìn)行細(xì)胞中GR表達(dá)的定位研究。作者簡(jiǎn)介：宮璀璀，女，41歲，主管技師。鄭州市鄭上路，Tel.(0371)78118002096作者單位：宮璀璀，韓玉春，胡延基，王大明，王文麗：解放軍第153中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州，4500421；楊書豪，李明，胡哲：鄭州博賽生物技術(shù)研究所參考文獻(xiàn)1Stein HJ, Hinder RA, Oosthvizen MMJ. Gastric mucosal injury caused

7、by hemorrhagic shock and reperfusion: protective role of the antioxidant glutathione. Surgery, 1990; 108:467474 2Friguet B, Ojavadi-ohaniance L, Pages J, et al. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site. Application to hybridomas specific for the 2-subunit of E.coli tryptophan synthase. J Immunol Meth, 1983; 60(3):351358 3李影林主編.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書.北京：第1版.人民衛(wèi)生出版社，1996：212821294Da