爪蟾卵母細(xì)胞固醇調(diào)控通路的建立及姜黃素的作用

1、爪蟾卵母細(xì)胞固醇調(diào)控通路的建立及姜黃素的作用                    作者：沃立科 范春雷 沃興德  【摘要】  目的在爪蟾卵母細(xì)胞中建立人類SCAP/SREBP固醇調(diào)控系統(tǒng)，利用此系統(tǒng)研究姜黃素對(duì)SCAP/SREBP調(diào)控通路的作用。方法構(gòu)建帶有綠色熒光報(bào)告蛋白基因的PLXRN4SREfpa質(zhì)粒，將構(gòu)建質(zhì)粒和其他幾種質(zhì)粒分別提取混和成實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒和對(duì)照組質(zhì)粒，通過(guò)微注射的方法

2、分別共注射到、爪蟾卵母細(xì)胞核內(nèi)，與不同濃度的姜黃素共孵育3天，使用熒光定量PCR檢測(cè)熒光表達(dá)量。結(jié)果相同濃度的姜黃素對(duì)注射含有固醇調(diào)節(jié)元件質(zhì)粒的卵母細(xì)胞熒光表達(dá)量要明顯高于不含相應(yīng)元件的質(zhì)粒。結(jié)論構(gòu)建的質(zhì)粒pLXRN4SREfPA能在爪蟾卵母細(xì)胞中有效地應(yīng)答SCAP、SREBP調(diào)控因子；通過(guò)影響SCAP/SREBP調(diào)控通路調(diào)節(jié)SRE1下游基因的表達(dá)可能是姜黃素調(diào)脂作用的機(jī)理之一；利用核內(nèi)共注射的方法在爪蟾卵母細(xì)胞中建立的SCAP/SREBP調(diào)控系統(tǒng)可作為SCAP配體類藥物快速篩選和作用機(jī)制研究的細(xì)胞模型。 【關(guān)鍵詞】  爪蟾卵母細(xì)胞 姜黃素 SCAP/SREBP固醇調(diào)控通路Abstr

3、act: Aim The expressed system of sterol regulation by SCAP/SREBP Pathway was established in the oocyte of the Xenopus laevis and was applied to investigate the effect of cucurmin on the SREBP pathway.Methods The plasmid of PLXRN4SREfpa was restructed and injected into the nucleus of Xenopus Oocytes

4、in phase V or VI. The oocyte was incubated with different concentrations of the curcumin. After three days the fluorescence intensity on the membrane of the Oocytes was measured by Fluoroanalyzer.Results The fluoresecence intensity on the membrane of the oocyte increased with increasing of the conce

5、ntration of the curcumin. The trail group which have all regulation elements of SCAP/SREBP pathway can express more fluorscence protein than the control group. Conclusion The experiment provides that the curcumin can upgrade the expression of low density lipoprotein receptor by SCAP/SREBP regulation

6、 pathway. The model can be applied for quick screening of the scap ligand drugs and inverstigating the mechanism of the drugs.Key words: Oocyte of Xenopus Laevis; curcumin; SCAP/SREBP regulation pathway    活血化瘀中藥姜黃中提取的姜黃素具備降血脂抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，特別是能夠降低血清膽固醇和甘油三酯,12其作用可能是通過(guò)對(duì)脂酶和低密度脂蛋白受體的調(diào)節(jié)。35我們考

7、慮姜黃素可能是通過(guò)SCAP/SREBP固醇調(diào)控系統(tǒng)，以SCAP配位體形式出現(xiàn)的高效低毒新型降脂藥。為了證明這一作用我們構(gòu)建了SCAP/SREBP固醇調(diào)控系統(tǒng)質(zhì)粒，經(jīng)核注射方法注入兩棲類爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，經(jīng)與不同濃度姜黃素孵育，通過(guò)檢測(cè)綠色熒光的量來(lái)分析姜黃素的作用。1  材料與方法11  材料  成年雌性非洲爪蟾，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，由本室飼養(yǎng)，可供常年使用。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5購(gòu)自上海生物工程有限公司；PCMVSREBP1a460,PCMVSCAP購(gòu)自ATCC公司；pQBI25fPA購(gòu)自Qbiogene公司；pBSKSRE委托上海生物工程有限

8、公司合成；PLXRN由BD Bioscience Clontech提供。姜黃素 (純度97%，HPLC)，購(gòu)自安徽甙爾塔天然有機(jī)化合物信息中心。12  方法121  基因合成：我們應(yīng)用PBSK質(zhì)粒，根據(jù)調(diào)節(jié)SREBP表達(dá)的調(diào)控元件SRE的堿基序列（5ATCACCCCAC3）設(shè)計(jì)了含有SRE調(diào)控元件的基因，并在調(diào)節(jié)元件下游設(shè)計(jì)了多克隆酶切位點(diǎn)，可方便插入目的基因和進(jìn)行質(zhì)粒重構(gòu)等基因操作。122  構(gòu)建質(zhì)粒pBSK4SREGFP:用限制性內(nèi)切酶NheI/MluI分別雙酶切pQI25fpa質(zhì)粒，pBSK4SRE質(zhì)粒經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，酶切鑒定，測(cè)序鑒定。123  構(gòu)建

9、質(zhì)粒pLXRN4SRE GFP:用限制性內(nèi)切酶SalI/BlnI分別雙酶切重組質(zhì)粒pBSK4SREfPA和pLXRN，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。根據(jù)pLXRN4SRE GFP質(zhì)粒的理論堿基序列，分別在插入的目的基因外側(cè)和內(nèi)部（GFP）設(shè)計(jì)了兩對(duì)PCR引物。外側(cè):P1，5TTTTGCTTTCGGTTTGGA3； P2，5CAGGAGCAAGGTGAGATG3。內(nèi)部:P3，5GATGACGGCAACTACAA3；P4，5CGAAAGGGCAGATTG3。以pLXRN4SRE GFP質(zhì)粒為模板，分別用P1/P2和P3/P4引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件均為94 50 s, 48 50 s, 72 5

10、0 s, 循環(huán)30次；取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。124  爪蟾卵母細(xì)胞顯微核注射：冰麻成年雌性爪蟾，單側(cè)剖腹取出爪蟾卵母細(xì)胞，使用型膠原酶消化過(guò)夜，選取高質(zhì)量、期爪蟾卵母細(xì)胞600枚，用堿裂解法分別提取pCMVSREBP1a460、pCMVSCAP、pLXRN、pLXRN4SREGFP等質(zhì)粒，使用核酸檢測(cè)儀進(jìn)行定量分析，將所有質(zhì)粒用無(wú)菌水稀釋到1ug/ul濃度，等體積混和pCMVSREBP1a460、pCMVSCAP、pLXRN4SREfpa作為實(shí)驗(yàn)組，等體積混和pLXRN4SREGFP、pCMVSCAP、pLXRN作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別對(duì)200枚蛙卵進(jìn)行核內(nèi)注射。另取200枚卵不作核注射，作為試劑空白組。125  姜黃素對(duì)SRAP/SREBP調(diào)控通路的影響：將每組200枚卵