滅蚊真菌貴陽腐霉原生質(zhì)體的制備和再生研究

1、滅蚊真菌貴陽腐霉原生質(zhì)體的制備和再生研究    【摘要】  目的：建立貴陽腐霉原生質(zhì)體的制備和再生系統(tǒng)，為該菌的基因工程和細(xì)胞工程改良提供適宜的真菌狀態(tài)。方法：對影響原生質(zhì)體形成的各因素，包括菌齡、消化酶的種類和比例、消化時間以及滲透壓穩(wěn)定劑的成分和濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較。結(jié)果： 以1 %纖維素酶與1 %溶壁酶11組合聯(lián)合脫壁，0.6 mol/L的甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑，酶解采用KPYG2培養(yǎng)基培養(yǎng)5254 h的貴陽腐霉菌菌絲，消化5 h所獲得的原生質(zhì)體數(shù)最多，原生質(zhì)體濃度可達(dá)到6.48×106個/ml；在0.6 mol/L甘露醇作滲透壓穩(wěn)定

2、劑的KPYG2培養(yǎng)基上，原生質(zhì)體再生率為0.043%。結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)所總結(jié)的原生質(zhì)體制備方法可以獲得在基因轉(zhuǎn)化或細(xì)胞突變誘導(dǎo)所需的原生質(zhì)體濃度。 【關(guān)鍵詞】  真菌； 貴陽腐霉； 原生質(zhì)體； 生物滅蚊； 滲透壓     Abstract Objective: To provide a suitable fungal material for protoplast-mediated genetic transformation and mutation induction of Pythium guiyangense Su. Methods: Condit

3、ions for the fungal protoplast preparation and regeneration including mycelium incubation time, various compounding of enzymes and osmotic stabilizers were examined. Results: Under the conditions as following: mixture of 1% lywallzyme and 1%cellulose （1:1） as digestive enzyme solution; 0.6mol/L D-Ma

4、nnitol as osmotic stabilizer, and 5h, of digestive time the obtained protoplast amount reached 6.48×106 each milliliter. A regeneration rate of 0.043% was obtained. Conclusion: A satisfied concentration of P. guiyangense protoplasts can be achieved with the preparation system developed in this

5、research.     Key words fungi; Pythium guiyangense Su; protoplasts; mosquito biocontrol; osmotic pressure     絲狀真菌貴陽腐霉（Pythium guiyangense Su）具有滅蚊能力強(qiáng)，繁殖能力快，易于人工培養(yǎng)以及對其他非靶生物相對安全等優(yōu)點(diǎn)1，具有良好的開發(fā)前景，但同時也存在著殺蟲速度慢，毒力不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，利用基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)對該菌株進(jìn)行改良勢在必行，而制備貴陽腐霉的原生質(zhì)體是重要的基礎(chǔ)工作之一。由于不同真菌的

6、細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不一樣，其原生質(zhì)體制備和再生所需要的條件也不一樣，需要作大量的實(shí)驗(yàn)來總結(jié)和篩選適合某一特定真菌的制備條件。2007年512月對貴陽腐霉原生質(zhì)體的制備和再生進(jìn)行研究，報(bào)道如下。     1  材料與方法     1.1  菌株  取自貴陽醫(yī)學(xué)院蚊蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室。菌絲在固體培養(yǎng)基上每7 d轉(zhuǎn)種1次，培養(yǎng)溫度（25±1 ）。     1.2  培養(yǎng)基  菌絲培養(yǎng)液（KPYG2）：葡萄糖1.5 g/L，酵母1.0 g/L，蛋白胨1.0

7、 g/L，氯化鈣0.075 g/L，膽固醇0.02 g/L，玉米油10 g/L。菌絲固體培養(yǎng)基：KPYG2加入瓊脂粉10 g/L。再生培養(yǎng)基：用滲透壓穩(wěn)定劑溶解KPYG2各成分，上層含瓊脂0.6%，下層含瓊脂2%。     1.3  滲透壓穩(wěn)定劑  氯化鈉、硫酸鎂為分析純，山梨醇、甘露醇為生化試劑。     1.4  酶的種類及酶液的配制  纖維素酶（Cellulase）為中科院上海生化所東風(fēng)生化技術(shù)公司產(chǎn)品，溶壁酶（Lywallzyme）為廣東省微生物研究所產(chǎn)品。酶液的配制及除菌采用滲透壓穩(wěn)定

8、劑配制所需濃度酶液，然后用0.22 m的微孔濾膜除菌，4 保存?zhèn)溆谩?    1.5  真菌培養(yǎng)條件  取固體培養(yǎng)基瓊脂塊1 cm×1 cm（長有菌絲）置于KPYG2中，110 r/min離心，溫度（25±1） ，培養(yǎng)4872 h。     1.6  原生質(zhì)體的制備  取菌絲約0.1 g于1.5 ml Ep管中，ddH2O洗滌兩次、滲透壓穩(wěn)定劑洗滌一次后，加入1 ml酶液，于37 恒溫?fù)u床上110 r/min進(jìn)行酶解。每隔30 min于顯微鏡下觀察一次原生質(zhì)體的數(shù)量。最終酶解

9、混合液經(jīng)4層擦鏡紙過濾到新的1.5 ml Ep管中，濾去菌絲殘片。濾液于2 000 r/min離心4 min，原生質(zhì)體懸于上層，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌3次。以上均為無菌操作，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原生質(zhì)體。     1.7  原生質(zhì)體的再生  取滲透壓穩(wěn)定劑重懸的原生質(zhì)體涂布于下層固體再生培養(yǎng)基上，再加4050 上層瓊脂培養(yǎng)基3 ml，迅速搖勻，（25±1） 溫育培養(yǎng)，形成的菌落數(shù)為（A）。另取原生質(zhì)體懸液加10倍無菌蒸餾水，使原生質(zhì)體破裂，再用同樣方法做對照，形成的菌落數(shù)為（B）。顯微鏡下觀察總原生質(zhì)體數(shù)為（C）。35 d后數(shù)菌落，計(jì)算再生

10、率：原生質(zhì)體再生率（A-B）/C×100%。     1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  原生質(zhì)體產(chǎn)量取3次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的均值。     2  結(jié)果     2.1  原生質(zhì)體產(chǎn)量  酶解3 h，貴陽腐霉原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)2.98×106個/ml,酶解5 h產(chǎn)量達(dá)6.84×106個/ml，如圖1。     2.2  影響貴陽腐霉原生質(zhì)體形成的因素  以1 %纖維素酶與1 %溶壁酶11組合聯(lián)合脫壁，

11、采用培養(yǎng)5254 h的菌絲，0.6 mol/L甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑，酶解時間為5 h。如圖2，圖3。 2.3  貴陽腐霉原生質(zhì)體形成過程  貴陽腐霉原生質(zhì)體有兩種生成方式，一種是菌絲被酶裂解為小片斷，原位形成原生質(zhì)體；一種是菌絲壁破洞，從頂端膨大釋放原生質(zhì)，形成原生質(zhì)體。原生質(zhì)體大小不一，但多數(shù)在1015 m。如圖4，圖5。 the tip of digested mycelia壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體再生率為0.043 %，以山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體再生率為0.019 %，而以氯化鈉、硫酸鎂做滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體再生率為零。    

12、;    3  討論     自Emerson2首次報(bào)導(dǎo)得到粗糙脈孢菌的類原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)以來，絲狀真菌原生質(zhì)體的研究在上世紀(jì)60年代取得了很大的進(jìn)步。由于真菌原生質(zhì)體相對于菌絲來說，具有無細(xì)胞壁障礙的優(yōu)點(diǎn)，在對真菌進(jìn)行基因工程改良和細(xì)胞水平的突變誘導(dǎo)篩選和原生質(zhì)體融合育種中被廣泛應(yīng)用。特別是近年來，真菌的原生質(zhì)體已從單純的實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)向生產(chǎn)具有工業(yè)價值的優(yōu)良菌株上，以此獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益3。由于不同真菌的細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不一樣，原生質(zhì)體的制備技術(shù)也不一樣，其中最重要的是消化細(xì)胞壁的酶種類和配比以及滲透壓穩(wěn)定劑種類的選擇，其次

13、采用的菌絲的天齡和細(xì)胞壁的酶解時間也很關(guān)鍵。     3.1  菌齡  菌絲體的菌齡對原生質(zhì)體釋放的影響主要由壁的成分和結(jié)構(gòu)的變化引起。菌齡短的菌絲體的壁成分相對簡單，壁也相對薄些，但并不是菌齡越短，原生質(zhì)體生成率越高，菌齡過短會造成菌絲量不足，或影響原生質(zhì)體的再生。不同種類的真菌酶解時最佳菌齡是不同的4。本研究顯示，培養(yǎng)5254 h的貴陽腐霉菌絲產(chǎn)生的原生質(zhì)體量較多，可能因?yàn)檫@個時期的菌絲細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)最適宜用酶解法制備原生質(zhì)體。同時，培養(yǎng)5254 h達(dá)到的菌絲量也夠用酶解法制備原生質(zhì)體。     3.2

14、60; 脫壁酶  由于不同種屬真菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同，所以選擇合適的脫壁酶對原生質(zhì)體的產(chǎn)量至關(guān)重要。一般來說，混合酶液比單一酶液的脫壁效果好。貴陽腐霉屬卵菌綱，細(xì)胞壁的成分主要為纖維素和葡聚糖4，針對貴陽腐霉的細(xì)胞壁成分，本實(shí)驗(yàn)選用了1 %纖維素酶和1 %溶壁酶11配比聯(lián)合脫壁。     3.3  酶解時間  實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)52 h的菌絲體制備原生質(zhì)體，酶解2 h后，每隔1 h取樣一次測定。結(jié)果顯示，隨著酶解時間延長，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加，5 h達(dá)最高；再延長酶解時間，原生質(zhì)體產(chǎn)量沒有增加，酶解過夜幾乎沒有原生質(zhì)體存在。這可能是因?yàn)?/p>

15、裂解酶對早期生成的原生質(zhì)體膜有破壞作用，影響原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性，原生質(zhì)體的不穩(wěn)定對再生率有不利影響。因此，酶解時間不宜過長，達(dá)到所需量的時候，應(yīng)盡快將酶液去除5。     3.4  滲透壓穩(wěn)定劑  滲透壓對所有生物的生長均有很大影響，真菌也是如此，如果滲透壓超過一定的限度，則引起環(huán)境脅迫，致使真菌死亡4。有報(bào)道稱，氯化鈉、硫酸鎂等無機(jī)鹽類和山梨醇、甘露醇等作滲透壓穩(wěn)定劑對于腐霉無效。而本實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)5254 h的貴陽腐霉菌絲，酶解5 h，以0.6 mol/L的甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑效果最佳，其次為0.6 mol/L山梨醇，另外，用氯化鈉作滲透壓穩(wěn)

16、定劑的效果也比較好。這可能是因?yàn)榇碱惐葻o機(jī)鹽更能維持原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性。     3.5  再生率  貴陽腐霉原生質(zhì)體再生率偏低，可能與原生質(zhì)體所處的生理狀態(tài)和外界因素有關(guān)6。貴陽腐霉的菌絲是無隔的，實(shí)際是多核細(xì)胞，所以酶解形成的原生質(zhì)體有的有核，有的無核。只有包含完整核和成套細(xì)胞器的原生質(zhì)體才能夠再生。故以這類菌絲為材料制備原生質(zhì)體的再生率比較低。     本研究采用1 %纖維素酶與1 %溶壁酶11組合聯(lián)合脫壁消化KPYG2培養(yǎng)基培養(yǎng)5254 h的貴陽腐霉菌絲5 h，用0.6 mol/L甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑所獲得

17、的原生質(zhì)體濃度可達(dá)到6.48×106個/ml。這一濃度高于何社輝于1995所獲得的大鏈壺菌原生質(zhì)體濃度7。分析原因，認(rèn)為一是菌種不同，二是本實(shí)驗(yàn)中所用的消化酶效力比較高。本研究成功的制備了貴陽腐霉的原生質(zhì)體，并初步實(shí)現(xiàn)了該原生質(zhì)體的再生，為后續(xù)的轉(zhuǎn)化工作及進(jìn)一步構(gòu)建毒力較強(qiáng)的工程菌株奠定了基礎(chǔ)。     何社輝1995年曾經(jīng)報(bào)道滅蚊真菌大鏈壺菌的原生質(zhì)體制備與再生7。貴陽腐霉與大鏈壺菌同屬卵菌綱，但是屬于不同的目，親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，因此本研究結(jié)果對腐霉屬及其相關(guān)真菌原生質(zhì)體制備有一定的價值。 【參考文獻(xiàn)】  1Su Xiao-qing.A new species of Pythium isolated from mosquito larvae and its ITS region of rDNAJ.Mycosystema,2006（4）:523-528. 2Emerson S，Emerson M R.Production,reproduction and reversion of protoplastlike structure in the osmotic strain of Neurospora crassaJ.Proe Nal