川芎嗪對腦缺血后不同腦區(qū)神經(jīng)元型NO合酶表達的影響

1、川芎嗪對腦缺血后不同腦區(qū)神經(jīng)元型NO合酶表達的影響         11-01-07 11:36:00     編輯：studa20                    作者：邱芬，劉勇，馬波，祁存芳，王文靜【摘要】  目的 通過觀察腦缺血后不同時間、不同腦區(qū)神經(jīng)元型NO合酶(

2、nNOS)的表達，探討川芎嗪對腦缺血后nNOS表達的影響。方法 成年雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、缺血模型組及川芎嗪低(20mg/kg)、中(40mg/kg)、高(80mg/kg)劑量組5組，每組按缺血后時間又分為1、3、7、14、21d 5個亞組。線栓法制作左側(cè)大腦中動脈阻塞模型，術(shù)后2h腹腔注射不同劑量的川芎嗪(1次/d)，至處死前2h。免疫組化染色觀察腦缺血后不同時間側(cè)腦室室下區(qū)(SVZ)、胼胝體(CC)、梗塞區(qū)周圍紋狀體和大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)及齒狀回(DG) nNOS表達。結(jié)果 假手術(shù)組各腦區(qū)不同時間nNOS的表達相近，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在SVZ，模型組11

3、4d nNOS表達降低，21d 時增高；川芎嗪各劑量組均表現(xiàn)為314d nNOS表達明顯降低，21d明顯增高。在CC，模型組314d明顯降低，21d有所回升；芎嗪各劑量組nNOS表達均表現(xiàn)為314d明顯降低，以中、高劑量組降低最為明顯，21d增高。在缺血周圍皮質(zhì)和紋狀體，模型組nNOS表達均表現(xiàn)為3、7d明顯降低，14、21d呈明顯增加趨勢；川芎嗪各劑量組nNOS的表達321d均較低，以中、高劑量組714d降低最為明顯，21d時稍有回升。在DG、CA1區(qū)，模型組3、7d nNOS表達明顯降低，14d時增高；川芎嗪各劑量組321d nNOS的表達均降低。各腦區(qū)不同時間點nNOS表達模型組與川芎嗪

4、各組間均存在明顯差異(P<0.05)。結(jié)論 川芎嗪對腦缺血后314d各腦區(qū)nNOS的表達有明顯抑制作用，提示川芎嗪可能通過抑制nNOS的表達、減少NO產(chǎn)生發(fā)揮其腦保護作用。 【關(guān)鍵詞】  川芎嗪；腦缺血；神經(jīng)元型一氧化氮合酶；室下區(qū)；胼胝體；紋狀體；齒狀回ABSTRACT: Objective  To observe the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in different encephalic regions and at different time points after foca

5、l cerebral ischemia in adult rats and explore the effect of Ligustrazine on nNOS expression. Methods  SD male adult rats were randomly divided into five groups: sham operation, ischemic model, low dose (20mg/kg), medium dose (40mg/kg) and high dose (80mg/kg) Ligustrazine groups. According to th

6、e time after ischemia, each group was further divided into 5 subgroups: 1, 3, 7, 14, and 21d (3 rats in each subgroup). Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by placement of an intraluminal filament at the origin of MCA. Ligustrazine was administered intraperitoneally at a da

7、ily dose of 20, 40 or 80mg/kg starting at 2h after MCAO, respectively, until 2h before sacrifice. Immunohistochemical staining was adopted to observe nNOS expression in subventricular zone (SVZ) of the lateral cerebral ventricle, corpus callosum (CC), striatum and cortex periinfarction, CA1 area, an

8、d dentate gyrus (DG). Results  Expression of nNOS at different time points was similar in sham operation group, with no significant difference (P>0.05). In SVZ, nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 1-14, but increased on day 21; after Ligustrazine administration, nNOS

9、expression was obviously decreased on days 3-14 in all Ligustrazine dose groups, but began toincrease on day 21. In CC, nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 3-14, and began to increase on day 21; in the differentdose Ligustrazine groups, nNOS expression was significantly decre

10、ased on days 3-14, especially in medium and highdose groups, but increased on day 21. In striatum and cortex periinfarction, nNOS expression in ischemic model group was obviously decreased on days 3 and 7, but enhanced on days 14 and 21; in variousdose Ligustrazine groups, nNOS expression was decrea

11、sed on days 3-21, especially in medium and highdose groups, but increased slightly on day 21. In DG and CA1 areas, nNOS expression in ischemic model group was reduced on days 3 and 7, but began to increase on day 14; nNOS expression in all Ligustrazine groups were decreased during 3-21d. There were

12、significant differences between ischemic model group and differentdose Ligustrazine groups at different time points (P<0.05). Conclusion  Ligustrazine has a significantly inhibitory effect on nNOS expression in different encephalic regions during 3-14d after focal cerebral ischemia, suggesti

13、ng that Ligustrazine might play a brainprotecting role by inhibiting nNOS expression and reducing NO production.KEY WORDS: Ligustrazine; cerebral ischemia; neuron NO synthase; subventricular zone (SVZ); corpus callosum (CC); striatum; dentate gyrus (DG)   在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，一氧化氮(NO)是一個具有信號傳遞功能的

14、自由基分子，腦實質(zhì)內(nèi)的NO由廣泛分布、表達神經(jīng)元型NO合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的特定神經(jīng)元合成。胚胎發(fā)育期間，室下區(qū)nNOS的表達增加，室下區(qū)內(nèi)或附近的遷移細胞表達nNOS，處于皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生高峰期的大腦皮質(zhì)板和海馬內(nèi)，NOS活性的暫短升高與干細胞增殖的停滯和細胞分化的時間一致，提示NO在胚胎期的神經(jīng)發(fā)生中起一定作用12。中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成時，NO的參與可能與神經(jīng)元的程序性細胞死亡、軸突投射模式的形成、細胞增殖的控制、遷移和分化的調(diào)節(jié)有關(guān)。NO在個體發(fā)育的不同階段和不同的腦區(qū)以及不同的生理病理狀態(tài)下所產(chǎn)生的作用并不相同35。有研究顯示，nNO

15、S在腦缺血后側(cè)腦室室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone, SGZ)區(qū)的細胞增殖、遷移和分化中發(fā)揮一定的作用。   川芎嗪(Ligustrazine, Lig)在臨床上用于治療腦梗塞療效肯定。研究表明川芎嗪能降低腦缺血再灌注后NOS活性，對腦缺血可能產(chǎn)生保護作用。我們以前的研究表明，川芎嗪能促進腦缺血誘導的SVZ和SGZ內(nèi)細胞的增殖和遷移68，其機制尚不清楚。為了探討川芎嗪的作用機制，我們觀察了川芎嗪對腦缺血后不同時間側(cè)腦室室下區(qū)SVZ、胼胝體(corpus callosum, CC)、梗塞區(qū)周圍紋狀體

16、和大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)、齒狀回 (dentate gyrus, DG) nNOS表達的影響。1  材料與方法1.1  材料成年雄性SD大鼠，體重220260g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。冰凍切片機(HM505 E, Zeiss, Germany)；圖像分析儀(Q550CW, 德國萊卡公司)。兔多克隆抗nNOS抗體(1200)、山羊抗兔IgG (即用型)和SABC復合液(即用型)均購自北京中山生物技術(shù)有限公司；DAB(博士德生物工程有限公司)；鹽酸川芎嗪注射液(無錫第七制藥有限公司)。1.2  方法SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺

17、血模型組及川芎嗪低、中、高劑量組5組，每組按缺血后時間分為1、3、7、14、21d 5個亞組，每組3只大鼠。采用線栓法制作左側(cè)大腦中動脈阻塞模型9。假手術(shù)組除不插入栓線外，其余操作步驟同缺血模型組。川芎嗪低、中、高劑量組術(shù)后2h分別腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液20、40、80mg/kg，1次/d，直至處死前2h。假手術(shù)組、缺血模型組腹腔注射等量的生理鹽水。在大鼠大腦中動脈阻塞后2h，參照改良的Bedersons評分方法9進行神經(jīng)功能缺失評分。選擇評分大于2分者進行下一步實驗。分別取各組腦缺血后1、3、7、14、21d一套切片行nNOS免疫組織化學染色。主要步驟如下：切片經(jīng)充分漂洗后，加入10mL/

18、L H2O2，室溫30min；10mL/L Triton X100，室溫30min；加入山羊血清封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫30min；加兔多克隆抗nNOS抗體(1200)，4冰箱過夜；Biotin標記的山羊抗兔IgG，室溫2h；滴加SABC復合液，室溫1h。上述各步驟之間均用0.01mol/L PBS(pH 7.4)充分漂洗3次，每次5min。DAB顯色。漂洗切片，晾干、脫水、透明、封片。陰性對照除不加入兔多克隆抗nNOS抗體外，其余步驟同上。在各觀察點上，每組取3只大鼠，每只大鼠取3張切片，間隔200m，在高倍鏡下隨機選取3個視野，應用Motic Images Advances 3.2圖像分

19、析軟件，測定各腦區(qū)nNOS陽性染色面積占選區(qū)面積的百分比。假手術(shù)組大鼠檢測左側(cè)半球各腦區(qū)內(nèi)nNOS的陽性表達面積占選區(qū)面積的百分比。數(shù)據(jù)資料使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，采用多因素方差分析，組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2  結(jié) 果2.1  nNOS在各腦區(qū)的分布 假手術(shù)組nNOS陽性細胞主要分布于CA1區(qū)、DG、SVZ、紋狀體、皮質(zhì)、基底前腦和胼胝體。在CA1區(qū)nNOS陽性細胞散在分布于錐體細胞層，突起并不長(圖1A)；DG nNOS陽性細胞分別位于顆粒細胞層、顆粒下層及門區(qū)，以顆粒細胞下層偏多(圖1B)；SVZ區(qū)的nNOS陽性細胞胞體位于SVZ外，其長的突起并不穿越SVZ和室管膜層(圖1C)；紋狀體nNOS陽性細胞較多，并發(fā)出長的突起連接成網(wǎng)(圖1D)；皮質(zhì)nNOS陽性細胞相對較少，散在分布，發(fā)出長的突起(圖1E)；基底前腦分布較多nNOS陽性細胞，但突起較短(圖1F)；胼胝體的nNOS陽性細胞散在分布，可見胞體及突起(圖1G)。2.2  各組腦缺血后SVZ nNOS的表達 腦缺血后nNOS陽性細胞的胞體位于SVZ外，其長的突起并不穿越SVZ和室管膜層，類似于假手術(shù)組。假手術(shù)組121d nNOS的表達相近，差異無統(tǒng)計學意義(P&