土壤中放線(xiàn)菌地分離與純化

1、土壤中放線(xiàn)菌的分離與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)特性，微生物的培養(yǎng)方法。2掌握微生物實(shí)驗(yàn)的基本生物技術(shù)，主要包括無(wú)菌操作技術(shù)，純種 分離技術(shù)，純種培養(yǎng)技術(shù)，以及抗生素檢測(cè)等。3掌握合成培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基的制備方法。4學(xué)習(xí)對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)的中出現(xiàn)問(wèn)題的分析，解決方法實(shí)驗(yàn)材料藥品：可溶性淀粉、KN03、NaCI、K2HPO4?3H2O、MgSO 4?7出0、 FeSO4?7H2O、瓊脂、重鉻酸鉀其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、 三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線(xiàn)繩、無(wú)菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、 酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。實(shí)驗(yàn)原理放線(xiàn)菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中（主要是

2、鏈霉 菌），其數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌。一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性 好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類(lèi)微生物的 混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群 體中分離出來(lái)，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線(xiàn)菌常用稀釋倒 平板法。根據(jù)放線(xiàn)菌的營(yíng)養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基 或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120 C熱 處理1h ）,或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細(xì)菌， 霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過(guò)稀釋法，使 放線(xiàn)菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。放線(xiàn)菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的

3、生長(zhǎng)，故可用金黃色葡 萄球菌（G+ ）和大腸桿菌（G-）作指示菌鑒別放線(xiàn)菌。高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線(xiàn)菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用 化學(xué)成分完全了解的純?cè)噭┡渲贫傻呐囵B(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCI、K2HPO4?3H2O、MgSO 4 ?7H2O作為無(wú)機(jī)鹽，F(xiàn)eSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵 離子等組成1.高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基的制備K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉 5g，硝酸鉀 0.25, MgSO4 ?7H2OO.125g , FeSO4?7H2O 0.025g，氯化鈉 0.125g，瓊脂 5g , 水 250ml。配制時(shí)，

4、先依次加入上述藥品（除瓊脂外）順序溶解，加入無(wú)菌水至250ml，調(diào)節(jié)pH = 7.4，再加入瓊脂不斷攪拌震蕩至溶化后，121 C滅菌20分鐘。將6套平皿、12只試管滅菌。2. 土壤中放線(xiàn)菌的分離1. 編號(hào)，分裝：取6套無(wú)菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀 釋液的稀釋度（10-3、10-4、10-5）。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。然后 在每皿中倒入已溶化并冷凝至 50 C左右的高氏一號(hào)培養(yǎng)基 1520ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml 一只盛有10ml無(wú)菌水的試管，排列于試管架 上，依次標(biāo)明 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2 .稀釋傾注分離稱(chēng)1g 土樣放入10m

5、l無(wú)菌水試管中振蕩10min，即10-1的土 壤懸液，靜置30s。用無(wú)菌吸管無(wú)菌操作取10-1濃度的土壤懸液1ml并加入編號(hào)10-2 的無(wú)菌試管中，并吹吸吸管23次，吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開(kāi)水面， 使其混合均勻。即為10-2濃度的土壤稀釋液。依此類(lèi)推，直到稀釋 至10-5的試管中（每個(gè)稀釋度換1支無(wú)菌吸管）。如圖-1T -4-5-fl-1-gQ101C 1U 10101010 L0 LCV-7-8J3 .倒平板分離培養(yǎng)于上述盛有不同稀釋度菌液的培養(yǎng)皿中，倒入溶化后冷卻至45 C左右的高氏培養(yǎng)基約10 15ml，置水平位置，迅速旋動(dòng)混勻，待凝 固。（若融化的培養(yǎng)基溫度太高，會(huì)產(chǎn)生太多的冷凝水，影響

6、觀(guān)察。）用1ml無(wú)菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌 液1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對(duì)應(yīng)兩個(gè)平板。 用無(wú)菌涂布棒（從濃度小液開(kāi)始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液 在整個(gè)平板表面涂勻，涂完一個(gè)平板用酒精燈滅菌。稀釋涂布平板法4培養(yǎng) 接種完畢，將平皿和試管放入28 C恒溫箱培養(yǎng)7天, 觀(guān)察平皿上放線(xiàn)菌（主要是鏈霉菌）菌落。菌種純化1、倒平板 將加熱融化的高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基倒平板，并標(biāo)號(hào)。2、平板劃線(xiàn)戈U線(xiàn)的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線(xiàn)，其目的都是通過(guò)劃線(xiàn)將 樣品在平板上進(jìn)行稀釋?zhuān)剐纬蓡蝹€(gè)菌落。常用的劃線(xiàn)方法有下列二 種:圖V -3劃線(xiàn)分離示意圖分區(qū)劃線(xiàn)用接

7、將培養(yǎng)皿底部用姆指和無(wú)名指固定成傾斜狀 態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁 刮取少許菌苔，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第 1次平行劃線(xiàn)67條, 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70 角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線(xiàn)部分作 第2次平行劃線(xiàn)(圖V -3)，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線(xiàn)。 劃線(xiàn)時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30 角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng) 皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線(xiàn)完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室 培養(yǎng)。連續(xù)劃線(xiàn)將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線(xiàn)(圖V -4 , B)。劃線(xiàn)完畢后，蓋上皿蓋，倒置 28 C培養(yǎng)。ABV 4劃線(xiàn)分離示意圖拮抗實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)出菌落后，要判斷是否

8、已分離到了純菌種。1配置鑒別培養(yǎng)基配置金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)基。2標(biāo)號(hào) 在兩平板上標(biāo)注均勻間隔的7個(gè)區(qū)域。2挑菌落 在純培養(yǎng)的平板上切取生長(zhǎng)較好的放線(xiàn)菌落依次放入 標(biāo)注區(qū)域中（在火焰旁切?。?，置于28 C恒溫箱培養(yǎng)1天后可觀(guān)察到 有抑菌圈生成。討論1高氏培養(yǎng)基的配置關(guān)鍵是pH值的調(diào)節(jié)和重鉻酸鉀的加入。放 線(xiàn)菌的最適生長(zhǎng)條件是2337，pH7.07.5，而在同樣條件下也利 于霉菌生長(zhǎng)。在咼溫殺菌下，放線(xiàn)菌和霉菌的孢子仍可以存活，所以 必須加入重鉻酸鉀抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)（對(duì)放線(xiàn)菌無(wú)抑制作用）。否則霉菌大量生長(zhǎng)。如圖培養(yǎng)基配置時(shí)各成分的溶解順序應(yīng)是先加緩沖化合物，后是主要元素、次要元素。調(diào)節(jié)

9、pH值時(shí)，加入酸堿要緩慢、少量、多加攪拌, 防止局部過(guò)酸或過(guò)堿而破壞營(yíng)養(yǎng)成分。我們第一次配置的高氏培養(yǎng)基很可能就是由于酸堿調(diào)節(jié)時(shí)酸堿過(guò) 量和未加入重鉻酸鉀而導(dǎo)致失敗。2 放線(xiàn)菌可以產(chǎn)生色素，且放線(xiàn)菌代表屬也分好幾種。其菌落一 般為圓形，菌落質(zhì)地致密表面呈較緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺， 地衣?tīng)?。表面干燥?？勺鳛殍b別菌種的基本參考依據(jù)。孢子絲生長(zhǎng)到一定階段可形成孢子由于孢子含有不同色素，成熟 的孢子堆也表現(xiàn)出特定的顏色，而且在一定條件下比較穩(wěn)定，故也是 鑒定菌種的依據(jù)之一。但孢子的形態(tài)和大小不能籠統(tǒng)地作為分類(lèi)鑒定 的重要依據(jù)。3整個(gè)過(guò)程要保證在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基及儀器可用高壓蒸 汽滅菌。接種時(shí)，實(shí)驗(yàn)桌要用95 %的酒精擦拭，且在接種時(shí)要在火 焰區(qū)的無(wú)菌范圍內(nèi)（空氣中含有大量灰塵、細(xì)菌和霉菌孢子等造成污 染）,且打開(kāi)培養(yǎng)基時(shí)間盡量短。4 稀釋倒平板法時(shí)涂布要均勻，否則，細(xì)菌密度不均導(dǎo)致菌落生 長(zhǎng)過(guò)于集中，細(xì)菌無(wú)法充分利用營(yíng)養(yǎng)成分影響生長(zhǎng)， 且在鑒別時(shí)較難 看到明顯的抑菌圈。稀釋時(shí)除了應(yīng)用平板涂布外還用了劃線(xiàn)法。涂布主要是通過(guò)稀釋 溶液方法減少細(xì)菌分布密度，劃線(xiàn)法