人線粒體DNA熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1、人線粒體DNA熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立        【摘要】  建立SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)人線粒體DNA的方法。選取人線粒體DNA高度保守基因片段，將該基因片段與pCF-T載體連接后，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5，提取重組質(zhì)粒PCR及測(cè)序鑒定后，作為陽(yáng)性模板建立SYBR-Green I熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。結(jié)果表明：構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(反應(yīng)體系中含101108拷貝時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)CT值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系)，相關(guān)系數(shù)為0.997。批內(nèi)和批間重復(fù)性測(cè)定的變異系

2、數(shù)分別為1.23%3.29%以及3.10%5.21%。我們成功建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人線粒體DNA的方法，該方法可作為進(jìn)一步研究線粒體DNA的方法，在相關(guān)疾病診斷和監(jiān)測(cè)中具有一定的應(yīng)用前景。 【關(guān)鍵詞】  SYBR Green I；熒光定量PCR；線粒體DNA；聚合酶鏈反應(yīng)；人    Key words：SYBR Green I; Fluorescent qunantitative PCR; Mitochondrial DNA；Polymerase chain reaction；Human    1  引&#

3、160; 言    線粒體作為真核細(xì)胞中一種重要而獨(dú)特的細(xì)胞器，其性狀和數(shù)量的改變與人的疾病密切相關(guān)。研究線粒體與疾病的關(guān)系，既有理論意義，在醫(yī)學(xué)上也有潛在的應(yīng)用前景。稱為細(xì)胞動(dòng)力工廠的線粒體，因其生命周期有限，具有高的更新率，形態(tài)、大小、數(shù)量和分布常因細(xì)胞種類不同而異。本研究旨在建立人線粒體DNA熒光定量PCR方法，為進(jìn)一步研究線粒體DNA與人的疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料    人EDTA抗凝血2 ml，菌種為

4、本室保存的大腸桿菌E.coli DH5。    1.2  試劑    pCF-T 連接試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑盒、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自TIANGEN公司；BigDye Terminator v3.1 試劑盒、SYBR PCR Mastermix  購(gòu)自ABI公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自灝洋生物公司。    1.3  儀器    BIO-RAD公司iCycler熒光定量PCR儀，HERAEUS公

5、司高速離心機(jī)BIOFUGEPICO，ABI公司 9700 PCR擴(kuò)增儀，大和公司恒溫金屬浴，BECKMAN公司紫外分光光度計(jì)DU-640，復(fù)星公司電泳儀，KODAK公司凝膠成像系統(tǒng)，ABI公司310測(cè)序儀。 1.4  目的片段引物的設(shè)計(jì)、合成    比較人線粒體DNA全序列，設(shè)計(jì)特異引物，引物由三博遠(yuǎn)志合成，序列如下:    上游引物：    5-ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-3；    下游引物：   

6、 5-CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-3。    1.5  DNA樣品的提取、擴(kuò)增及回收    取人EDTA抗凝血2 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，分別吸取人單個(gè)核細(xì)胞（1×106/mL）5 ul，離心，棄上清。放入20 ul裂解液中(Chelex reagent), 56 消化1 h，98 10 min, DNA樣品-20保存。PCR 反應(yīng)體系：上下游引物各1 ul （10  umol/L）、dNTPS 2 ul、Taq DNA聚合酶0.5 ul、10

7、5;Taq Buffer 2.5 ul、DNA樣品2 ul、ddH2O 16 ul,輕輕混勻，短暫離心，按照下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:94預(yù)變性5 min；95 30 s、55 45 s、72 45 s,共35個(gè)循環(huán)；72延伸3 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳、檢測(cè)，并用膠回收試劑盒純化回收。    1.6  克隆載體的構(gòu)建    回收的片段與pCFT載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5菌，然后利用Amp抗性進(jìn)行篩選。從平板中挑出7株轉(zhuǎn)化菌，按質(zhì)粒抽提試劑盒提供的方案配液、提取。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR電泳鑒定，鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒用測(cè)序證實(shí)。1

8、            1.7  熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作    用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度人線粒體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成拷貝濃度，用水10倍梯度稀釋成108-101拷貝/u1。使用SYBR PCR Mastermix kit（ABI）,BIO-RAD iCycler PCR儀測(cè)定擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線,總反應(yīng)體系為25 L。內(nèi)含:上下游引物(10 mol/L)各1 L, SYBR PCR Mastermix  12.5 L，模板1 L，PCR

9、級(jí)水8.5 L。反應(yīng)條件為: 95 5 min；95 30 s，55 45 s，72 45 s，每循環(huán)延伸后檢測(cè)熒光，共38個(gè)循環(huán)，72 7 min。    1.8  熔解曲線的制作    95 2 s后以0.3/3 s降溫到65，連續(xù)檢測(cè)熒光信號(hào)，繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線,以了解樣品擴(kuò)增的特異性,保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。    2  結(jié)果    2.1  重組質(zhì)粒的鑒定和DNA序列分析    將構(gòu)建重組質(zhì)粒用設(shè)計(jì)的

10、引物進(jìn)行擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)特異的目的條帶（405bp），見(jiàn)圖1。鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖2，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果序列完全相同，說(shuō)明目的片段已經(jīng)成功重組。    2.2  標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系    反應(yīng)體系中含1×1011×108拷貝分子時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)CT值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=-3.320X+38.983，其中Y為CT值，X為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)，見(jiàn)圖3。 標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出相關(guān)系數(shù)為0.997。    2.

11、3  標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏性    將線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)品做梯度稀釋(1×1011×108)，進(jìn)行熒光定量PCR，得到系列曲線，至每個(gè)梯度均有特征性擴(kuò)增曲線，呈明顯的“S”型，見(jiàn)圖4。說(shuō)明用此引物通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定人線粒體DNA敏感性好。    2.4  特異性    用抽提的線粒體DNA作為陽(yáng)性模板，結(jié)果與預(yù)期完全相符,無(wú)非特異性擴(kuò)增。而非靶模板的反應(yīng)孔無(wú)熒光信號(hào)出現(xiàn)。熔解曲線只見(jiàn)一特異性峰, 見(jiàn)圖5，說(shuō)明此引物特異性高，表明該方法有良好的特異性。 

12、0;  2.5  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)    將系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用熒光定量PCR重復(fù)測(cè)定3次,每次每個(gè)稀釋度重復(fù)3管。結(jié)果表明,用該方法檢測(cè)的批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.23%3.29%以及3.10%5.21%,說(shuō)明該方法具有較好的可重復(fù)性及再現(xiàn)性。    3  討論    線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，不僅維持細(xì)胞正常生理功能，在細(xì)胞凋亡和死亡中也發(fā)揮重要作用。線粒體是細(xì)胞能量生成場(chǎng)所，通過(guò)氧化磷酸化為有機(jī)體，提供90%的ATP能源；參與尿素循環(huán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，從而

13、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。線粒體參與細(xì)胞凋亡功能的發(fā)現(xiàn)加深了對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的理解。它還產(chǎn)生還原性物質(zhì)有利于細(xì)胞的解毒功能?？梢?jiàn)，線粒體在生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進(jìn)化等方面都有非常重要的意義。    近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)mtDNA與腫瘤之間的關(guān)系有所研究，并提出了一些假說(shuō)，已有的研究資料提示腫瘤的生物學(xué)特征不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的線粒體DNA也有一定的關(guān)系1，可能與易受損傷而不易修復(fù)有關(guān)。線粒體DNA基因組缺乏損傷修復(fù)系統(tǒng)而又直接暴露于氧化磷酸化過(guò)程所產(chǎn)生的高氧環(huán)境，是其發(fā)生損傷的重要因素。加之線粒體基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1)線粒體內(nèi)脂肪/DNA的

14、比值很高，使具有嗜脂性的致癌物優(yōu)先在占細(xì)胞總DNA量很少的線粒體DNA聚集2；(2)線粒體DNA缺乏組蛋白的保護(hù)，即是裸露的。因此線粒體DNA是致癌物作用的重要靶點(diǎn)，其損傷程度和突變率顯著高于核DNA（大約10倍于核）3。由于線粒體DNA修復(fù)機(jī)制發(fā)育不良，效率低下，線粒體DNA的突變導(dǎo)致線粒體功能缺陷，線粒體DNA只有過(guò)度復(fù)制產(chǎn)生驚人的拷貝數(shù)才能補(bǔ)償此缺陷4。因此需要建立一個(gè)定量檢測(cè)線粒體DNA的方法。    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。SYBR

15、 Green 是雙鏈DNA熒光染料,通過(guò)特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)出熒光，因此，PCR 反應(yīng)中SYBR Green的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的增加一致5-7 。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，SYBR Green熒光定量PCR擴(kuò)增具有高效性和高敏感性，可進(jìn)行定量分析，且通過(guò)產(chǎn)物熔解分析可確定產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)全程為閉管操作，檢測(cè)結(jié)果由機(jī)完成分析，提高了工作效率，防止了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。與Taqman探針?lè)ㄏ啾?，操作?jiǎn)單且成本低。    本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)構(gòu)建人線粒體DNA的質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，采用SYBR Green熒光定量PCR方法，建立了線粒體DNA的定量檢測(cè)方法。結(jié)果顯示

16、，反應(yīng)體系具有較高的檢測(cè)敏感性，能檢測(cè)到低載量（10 拷貝）的模板；模板濃度在101108拷貝反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系具有良好的重復(fù)性和特異性。與傳統(tǒng)PCR相比，擴(kuò)增效率高，并降低了產(chǎn)物可能引起的潛在污染。因此該方法的成功建立，在線粒體相關(guān)疾病的診斷、的監(jiān)測(cè)中有一定的應(yīng)用前景?！尽?#160; 1馮作化.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005：149.2Shay JW, Werbin H. New evidence for the insertion of mitochondrial DNA into the human genome: significance for cancer and agingJ. Mutat Res,1992, 275(36):227-235. 3高澤.線粒體DNAM.北京:出版社,1982：1-4.4Bianchi NO, Bianchi MS, Richard SM. Mitochondrial genome instability in human cancersJ. Mutat Res,2001,488(1):9-23.5Simpson DA, Feeney S, Boyle C,et al. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescenc