毛冬青藥材中毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2的含量測定的研究

1、毛冬青藥材中毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2的含量測定的研究    【摘要】  目的建立毛冬青藥材的含量測定方法。方法采用Lichrospher-C18色譜柱(4.0 mm×250 mm，5 m)，流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(3763)，流速1 ml/min，蒸發(fā)光散射檢測器：漂移管溫度107，氣體流速2.6 L/min。結(jié)果毛冬青皂苷甲在5.1964.88 g濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 8(n=6)，平均回收率為100.26 %，RSD= 1.09 % (n= 6);毛冬青皂苷B2在0.911.25 g濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系

2、良好，r=0.999 7(n=6)，平均回收率為101.39 %，RSD=1.46 % (n=6)。結(jié)論該法操作快速、準確，可作為毛冬青藥材的質(zhì)量控制方法。 【關(guān)鍵詞】  毛冬青藥材; 毛冬青皂苷甲; 毛冬青皂苷B2; 高效液相-蒸發(fā)光散射 Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC-ELSD method for the determination of Ilexsaponin A1 and Ilexsaponin B2 contents in Ilex Pubescens. MethodsLichroshper-C1

3、8 (4.0 mm×250 mm，5 m) column was used in HPLC with An evaporative light-scattering detector.Mobile phase was Acetonitrite-0.1%Acetic acid (3763), the flow rate was 1 ml/min: drift tube temperature was 107,and gas flow rate was 2.6 L/min. ResultsThe linear range of ilexsaponin A1 was within

4、 5.19 64.88 g, r=0.999 8(n=6).The average recovery was 100.26%，RSD=1.09% (n=6). The linear range of ilexsaponin B2 was within 0. 9 11.25 g,r=0.999 7(n=6). The average recovery was 101.39%，RSD=1.46% (n=6). ConclusionThis method is rapid and accurate. It can be used for quality control of Ilex Pu

5、bescens. Key words： Llex pubescens; Llexsaponin A1; Ilexsaponin B2; HPLC-ELSD 毛冬青藥材為冬青科冬青屬植物毛冬青Ilex pubescens Hook et Arm 的干燥根，生長在我國南方地區(qū)，具有清熱解毒，活血通脈，消腫止痛的功效。近年來對毛冬青的許多研究證明毛冬青藥材中含有大量的皂苷類活性物質(zhì)14。為了很好的利用這一資源，我們對毛冬青藥材進行了質(zhì)量控制技術(shù)的研究，建立高效準確的分析測定方法，本文首次采用高效液相-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)的測定方法，同時對毛冬青藥材中的毛冬青皂苷甲和毛

6、冬青皂苷B2兩種成分進行了含量測定的方法學研究5，取得了滿意的結(jié)果。 1 儀器和試藥 島津LC-10AD泵，Alltech 500 ELSD檢測器，Sepu3000色譜工作站。毛冬青皂苷甲對照品(批號：081211，含量100%)自制;毛冬青皂苷B2對照品(批號：080709，含量100%)自制。毛冬青藥材：各地采挖。乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為重蒸水。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件色譜柱為Lichrospher 100 RP-18 (4.0 mm×250 mm，5m);流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(3763);流速1ml

7、/min;蒸發(fā)光散射檢測器(飄移管溫度為107，氣體流速為2.6 L/min)。 2.2 測定方法 2.2.1 對照品溶液的制備 取毛冬青皂苷甲對照品和毛冬青皂苷B2對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含毛冬青皂苷甲為4 mg;毛冬青皂苷B2為0.9 mg的混合溶液，即得。 2.2.2 供試品溶液的制備取毛冬青藥材粉末(過4號篩)，約1.5 g，精密稱定，置250 ml回流瓶中，加100 ml的乙醇，回流2 h，取下，濾過，然后用乙醇洗滌數(shù)次，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解到10 ml量瓶中，搖勻，即得。 2.2.3 測定法分別精密吸取對照品溶液5 l和10

8、 l;供試品溶液510 l注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程計算，即得。 2.3 專屬性實驗取對照品和供試品溶液按上述方法進行測定，結(jié)果在毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2對照品相應(yīng)的保留時間處有相同的峰，周邊無其它雜質(zhì)峰干擾。毛冬青皂苷B2的保留時間在9 min左右，毛冬青皂苷甲的保留時間在11 min左右，理論板數(shù)以毛冬青皂苷甲的峰計大于8 000。結(jié)果見圖1。 2.4 蒸發(fā)光散射檢測器的條件考察 2.4.1 漂移管溫度的選擇在上述色譜條件下，先固定漂移管的氣流量為2.5 L/min，改變漂移管溫度，用毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲混合對照品溶液進樣，記錄色譜圖，測定兩

9、個對照品的峰面積及信噪比(S/N)，選擇峰面積和信噪比兩者均為最大值時的溫度，從實驗結(jié)果中得到最優(yōu)化的漂移管溫度為107。 2.4.2 漂移管中氣流量的選擇在上述色譜條件下，固定漂移管的溫度為107，改變漂移管的氣流量，用毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲混合對照品溶液進樣，測定兩個對照品的峰面積及信噪比(S/N)，選擇峰面積和信噪比兩者均為最大值時的氣流量，從實驗結(jié)果中得到最優(yōu)化的漂移管氣流量為2.6 L/min。因此，蒸發(fā)光散射檢測器的條件選擇：飄移管溫度為107，氣體流速為2.6 L/min。 2.5 標準曲線的制備分別取毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲對照品各約9 mg和52

10、 mg，同置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，從中吸取1，2，5，7.5，10和12.5 l注入色譜儀中進行測定，結(jié)果毛冬青皂苷甲在5.19 64.88 g的范圍內(nèi)，濃度與峰面積的對數(shù)值呈一直線，回歸方程為logA=1.329 7 logC + 4.6775, 相關(guān)系數(shù) r=0.999 8( n=6 );毛冬青皂苷B2在0.9 11.25 g的范圍內(nèi)，濃度與峰面積的對數(shù)值呈一直線，回歸方程為logA = 1.551 8 logC + 4.512 6 , 相關(guān)系數(shù)r=0.999 7( n=6 )。1. 毛冬青皂苷B2 2. 毛冬青皂苷甲圖1 混合對照品(A)和樣品(B)色譜圖 

11、;2.6 溶液的穩(wěn)定性實驗取供試品溶液1份，在不同的時間點測定，結(jié)果在24 h內(nèi)穩(wěn)定性很好。 2.7 重復性實驗取同一批毛冬青藥材，分別制配6份相同濃度的供試品溶液進行測定，計算得毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2的平均含量分別為2.09%和0.44%，RSD分別為0.85%和1.33%。 2.8 回收率實驗取同一批毛冬青藥材適量，加入一定量的毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲對照品，共6份，制成供試品溶液，進行測定，計算毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2平均回收率分別為100.26%和101.39%，RSD分別為1.09%和1.46%。結(jié)果見表12。表1 毛冬青皂苷甲的回收率實驗結(jié)果

12、60;2.9 藥材的測定對從不同產(chǎn)地、不同時間采集的毛冬青藥材，經(jīng)干燥粉碎，過4號篩，分別取1.5 g，精密稱定，按上述方法操作，測定。結(jié)果見表3。表2 毛冬青皂苷B2的回收率實驗結(jié)果表3 毛冬青藥材含量測定結(jié)果 3 討論 毛冬青藥材中的大部分皂苷類物質(zhì)沒有紫外吸收，我們采用蒸發(fā)光散射檢測器對其中的皂苷類物質(zhì)進行檢測，可得到滿意的結(jié)果。 本藥材試用過不同濃度的乙醇和甲醇，超聲和回流提取不同的時間，實驗結(jié)果表明，毛冬青藥材采用95%乙醇100 ml，回流2 h，提取比較完全，毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2的含量均最高。 本法中濃度和峰面積的對數(shù)值曲線為一良好

13、的直線，此直線未過原點，因此在本方法中應(yīng)采用外標兩點對數(shù)方程來進行計算。測定時分別精密吸取混合對照品溶液5 l和10 l;及供試品溶液510 l注入液相色譜儀。 本方法經(jīng)實驗證明，準確性高，重復性好，簡便快速，適合作為毛冬青藥材的質(zhì)量控制方法。 【參考文獻】  1 宋立人，洪 恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學大辭典，上冊M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：419. 2 王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學M.天津：天津科學技術(shù)出版社，1999：919. 3 Kazuyuki Hidaka, Miyoko Ito, Yoko Matsuda，et al. New Triterpe