液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)血液中8種有毒生物堿

1、液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)血液中8種有毒生物堿         11-04-22 16:16:00     作者：熊小婷 吳惠勤    編輯：studa20【摘要】  建立了高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)血液中8種有毒生物堿的方法。血液樣品經(jīng)過(guò)乙酸銨氨水緩沖溶液(pH9)處理后，以甲醇提取，采用電噴霧電離(ESI)、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式，可同時(shí)對(duì)麻黃堿、毛果蕓香堿、士的寧、阿托品、鉤吻素子、馬錢子堿、烏頭堿、喜樹(shù)堿

2、8種有毒生物堿進(jìn)行定性和定量分析。在優(yōu)化的條件下，上述前4種組分在1100 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，后4種組分在2.5500 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。8種有毒生物堿的提取回收率在83.1%104.0%范圍內(nèi)。士的寧、阿托品、馬錢子堿、烏頭堿和鉤吻素子檢出限為0.05 g/L，定量限為0.1 g/L;麻黃堿、毛果蕓香堿、喜樹(shù)堿的檢出限為0.1 g/L，定量限為0.5 g/L。各組分的日內(nèi)RSD小于9%，日間RSD小于10%。本方法操作簡(jiǎn)便快捷、選擇性好、靈敏度高，適用于中毒診斷和法醫(yī)毒物分析。 【關(guān)鍵詞】  高效液相色譜， 電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜， 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)， 同時(shí)檢測(cè)， 有毒生物堿，

3、血液            1 引 言天然結(jié)構(gòu)生物堿是中草藥的重要藥效成分，而與此同時(shí)，因不當(dāng)治療、臨床用藥過(guò)量、誤食、蓄意投毒等而導(dǎo)致的劇毒生物堿中毒的案件也時(shí)有報(bào)道。因此，建立快速、靈敏、可靠的中毒樣品中痕量生物堿的分析檢測(cè)方法具有重要意義。含有毒生物堿的植物分布極其廣泛，在各科各屬中均有分布，如毛莨科的草烏、附子等含有烏頭堿;馬錢科的馬錢子含馬錢子堿、士的寧，鉤吻含鉤吻素子;茄科的洋金花，曼陀羅等含阿托品。這些生物堿的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、類型多樣，毒性大，中毒劑量很低(如：烏頭堿小鼠經(jīng)口L

4、D50為1.8 mg/kg，對(duì)人的中毒劑量(口服)為0.12 mg，致死量為35 mg1)，在中毒病人體液中含量極低，中毒無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，這些特性使得有毒生物堿的分析鑒定成為一個(gè)難題。目前，對(duì)于體液中有毒生物堿的檢測(cè)常用的方法有高效液相色譜法(HPLC)2,3、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GCMS)4,5以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LCMS)614。HPLC檢出限通常在100 g/L以上4,5，很多情況下不能滿足毒物鑒定的需要，且僅以保留時(shí)間進(jìn)行定性分析存在不足，目標(biāo)物濃度低時(shí)基質(zhì)干擾嚴(yán)重、選擇性差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;GCMS適用于揮發(fā)性成分的分析，而生物堿大多為高沸點(diǎn)化合物，需要衍生化后才能進(jìn)行分析，

5、操作繁瑣。LCMS具有液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度，并且可以得到化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、特征結(jié)構(gòu)碎片等信息，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)可進(jìn)一步提高靈敏度與選擇性，在中毒樣品的痕量分析方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，利用LCMS技術(shù)檢測(cè)生物樣品中有毒生物堿的分析的大部分研究?jī)H限于對(duì)某一種或來(lái)源相同的某幾種生物堿的檢測(cè)612，對(duì)來(lái)源不同的多種有毒生物堿檢測(cè)的研究很少13,14，并且存在覆蓋范圍不廣13，以及提取回收率低的不足14。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)對(duì)人血中多種來(lái)源不同有毒生物堿的LCMS/MS檢測(cè)方法，并對(duì)方法的回收率、穩(wěn)定性、重復(fù)性等進(jìn)行了驗(yàn)證。此法可大大提高檢測(cè)效率，避免漏檢，已在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)用。

6、2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器與試劑1200 RRLC高分離度快速液相色譜儀、6410B Triple Quad三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。XK96A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);AS 3120超聲波發(fā)生器(Auto Science公司); TDL40B離心機(jī)(Anke 公司);HGC12氮吹儀(上海歡奧科貿(mào)有限公司)。馬錢子堿、士的寧、喜樹(shù)堿、硫酸阿托品和硝酸毛果蕓香堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，烏頭堿、鉤吻素子和鹽酸麻黃堿(天津一方科技有限公司)，純度均>95%，用分析純甲醇配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 冰箱中。甲醇(色譜純，SK Chemical公司)，

7、甲醇、氨水和乙酸銨(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)， 二次蒸餾水(自制)。2.2 樣品前處理取血液0.5 mL于10 mL離心管中，加入1 mL乙酸銨氨水緩沖溶液(pH9)，充分混勻，加入2 mL甲醇，渦流混合2 min，超聲10 min，4500 r/min 離心10 min，取上清液，重復(fù)提取一次，合并上清液，45 下用氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL起始梯度流動(dòng)相V(甲醇)V(100 mmol/L乙酸銨)=1溶解，過(guò)0.22 m微孔濾膜，待分析。2.3 色譜與質(zhì)譜條件Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm× 2.1 mm， 1.8 m);流動(dòng)相：1

8、0 mmol/L 乙酸銨水溶液(A)+甲醇(B)，流速：0.3 mL/min;梯度洗脫程序：01 min, 20%35% B; 14 min, 35% B; 45 min, 35%60% B;56 min， 60%70% B;67 min，70%20%B。柱溫：30 ，進(jìn)樣量：5 L。電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，干燥氣溫度： 350 ，干燥氣流速： 9 L/min，霧化氣壓力： 275.8 kPa，毛細(xì)管電壓： 4 kV。3 結(jié)果與討論3.1 提取條件的選擇血液樣品含有蛋白質(zhì)，直接加入有機(jī)提取溶劑會(huì)導(dǎo)致樣品中蛋白質(zhì)沉淀，提取溶劑不易滲透進(jìn)樣品中;且生物堿一般具

9、有堿性，在堿性環(huán)境下可游離出來(lái)，易溶于有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)在提取前加入兩倍量的堿性緩沖溶液稀釋樣品，在提高分散程度的同時(shí)可使生物堿游離出來(lái)，加大在有機(jī)相中的分配比例。針對(duì)各生物堿的性質(zhì)，考察了以乙醚14、乙醚二氯甲烷(11, V/V)、乙酸乙酯、氯仿、甲醇為提取劑的提取效果，其回收率分別為41.6%73.9%， 57.5%93.8%， 44.4%86.6%， 46.9%95.5%， 81.0%103.0%?？梢?jiàn)，只有用甲醇提取時(shí)，8種生物堿的提取回收率都能達(dá)到80%以上，故選擇甲醇為提取劑。3.2 色譜條件的優(yōu)化考察了以0.2%甲酸水溶液、10 mmol/L 乙酸銨溶液和20 mmol/L 乙酸銨

10、+1%乙酸水溶液為流動(dòng)相A，甲醇和乙腈為流動(dòng)相B的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以10 mmol/L 乙酸銨水溶液(A)+ 甲醇(B)為流動(dòng)相可使各組分得到較好的分離和較好的響應(yīng)。采用0.2%甲酸水溶液(pH3)與采用10 mmol/L 乙酸銨溶液(pH7)時(shí)，各組分的出峰順序發(fā)生改變。A采用前者時(shí)出峰順序?yàn)槊|香堿、麻黃堿、士的寧、阿托品、鉤吻素子、馬錢子堿、烏頭堿、喜樹(shù)堿，采用后者時(shí)出峰順序?yàn)槁辄S堿、毛果蕓香堿、阿托品、士的寧、馬錢子堿、鉤吻素子、喜樹(shù)堿、烏頭堿，說(shuō)明改變流動(dòng)相的組成和pH值會(huì)影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用，從而改變它們的保留行為。這8種生物堿都具有不同程度的堿性，在pH較高的流動(dòng)

11、相中會(huì)更多地以游離的形式存在，疏水締合作用更強(qiáng);另一方面，喜樹(shù)堿、毛果蕓香堿含有內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)、馬錢子堿和士的寧含有雜環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)，在pH較高的環(huán)境中易開(kāi)環(huán)形成羧酸鹽，降低與鍵合相的疏水作用，改變保留狀況。兩方面的綜合作用使各組分的保留值隨pH的改變產(chǎn)生不同程度的改變，從而改變出峰順序。3.3 溶劑效應(yīng)的影響樣品吹干后用甲醇溶解進(jìn)樣分析，進(jìn)樣2 L以上時(shí)，峰展寬現(xiàn)象很嚴(yán)重，峰形不佳;改用梯度洗脫中間段的流動(dòng)相(60%甲醇)溶解，效果有所改善;用起始梯度的流動(dòng)相(20%甲醇)溶解，效果明顯好轉(zhuǎn)，進(jìn)樣10 L仍能得到較好峰形。3種情況下進(jìn)樣5 L的MRM色譜圖如圖1所示。從圖1可見(jiàn)，用不同溶劑溶解對(duì)先出峰組分的峰形影響較大，后出峰的組分幾乎不受影響，這種情況是由于溶劑效應(yīng)的影響所致。A： 甲醇(Methanol);B： 甲醇(Methanol)10 mmol/L 乙酸銨溶液(Ammonium acetate)=32(V/V);C： 甲醇(Methanol)10 mmol/L乙酸銨溶液(Ammonium acetate