大薊總黃酮對荷瘤小鼠白細胞介素1和白細胞介素2的影響

1、大薊總黃酮對荷瘤小鼠白細胞介素1和白細胞介素2的影響         09-09-10 10:10:00     編輯：studa20                        作者：劉素君 周澤斌，胡霞，張杰【摘要】  目的在分子水平

2、上探討大薊總黃酮的抗腫瘤機制，主要研究大薊總黃酮對荷瘤小鼠白介素1（IL1）和白介素2（IL2）的影響。方法通過RT-PCR方法半定量檢測腫瘤小鼠細胞產(chǎn)生IL1 mRNA和IL2 mRNA的量來研究大薊總黃酮能否促進腫瘤小鼠細胞產(chǎn)生IL1 mRNA和IL2 mRNA。結果大薊總黃酮能夠極為顯著地提高腫瘤小鼠細胞產(chǎn)生IL1和IL2的轉錄水平（P<0.01）。結論 大薊總黃酮能明顯地促進腫瘤小鼠IL1和IL2 mRNA的表達。 【關鍵詞】  大薊總黃酮 白細胞介素 1 白細胞介素 2Abstract:ObjectiveIn order to further exploit the

3、anti-tumor mechanism of total flavones in Cirsium japonicum DC at molecular level, the effects of the total flavones on the interleukin 1（IL1） and interleukin 2（IL2） in the tumor-bearing mice were studied. MethodsThe IL1mRNA and IL-2mRNA detected in the spleen cells and abdominal cells of the tumor-

4、bearing mice by highly sensitive RT-PCR technology. ResultsThe total flavones in Cirsium japonicum DC could enhance the expression of IL1 and IL2 mRNA（P<0.01）.ConclusionThis study suggested that the total flavones in Cirsium japonicum DC can enhance the expression of IL1 and IL2 mRNA.Key words:Th

5、e total flavones in Cirsium japonicum DC；  IL1；  IL2大薊為菊科管狀花亞科菜薊族薊屬植物Cirsium jiaponicum DC.的干燥地上部分或根1，我國各地均產(chǎn)。大薊性涼，味甘、苦，歸心、肝經(jīng)，功效為涼血止血、祛淤止痛。大薊的主要成分為黃酮類化合物，文獻報道其多聚乙炔具有抗腫瘤作用2。其總黃酮在體內(nèi)有抗腫瘤作用并能提高腫瘤小鼠的免疫功能3。   細胞因子是具有免疫調(diào)節(jié)作用的一類重要蛋白質(zhì)物質(zhì)。許多中藥可以通過激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，誘生多種細胞因子(如促進干擾素生成，促進白細胞介素生成，誘生腫瘤壞死因

6、子等)來增強動物免疫功能。白細胞介素(IL)能活化B細胞、巨噬細胞、NK細胞,近年來研究發(fā)現(xiàn)許多中藥都有促進細胞因子產(chǎn)生的作用。例如枸杞子能促進老年小鼠產(chǎn)生IL-2；中華獼猴桃提取物能使小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液中IL-2活性明顯升高；黃芪多糖能使大黃脾虛模型小鼠低下的IL-2活性升高，而對正常小鼠無影響；青蒿素抑制IL-2的產(chǎn)生；銀耳多糖高濃度時則降低小鼠脾細胞培養(yǎng)液中的IL-2的活性4。一般來說，細胞中某種mRNA的數(shù)量是其編碼基因活性的直接反映。所以某種mRNA的定量是隨著在不同的時空狀態(tài)下編碼基因表達活性的變化而有所不同。RTPCR具有很高的敏感性5，6，可以用來分析不同的組織、或相同組織不

7、同發(fā)育階段中mRNA表達狀況的相關性。1  器材與方法1.1  供試動物昆明種標準小鼠，體重（21±2）g，雌雄各半，由四川中藥研究所提供BalB/C純種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學動物中心提供C57BL/6J純種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學動物中心提供。1.2 大薊總黃酮的制備 將大薊70%乙醇提取物與硅藻土拌樣揮干后,裝入玻璃管柱中，用石油醚流洗,去除其中的葉綠素和極性較小的成分；流洗結束后倒出硅藻土化合物，揮干溶劑重新裝入玻璃管柱，正丁醇流洗提取，用1%三氯化鋁乙醇溶液與黃酮類化合

8、物在濾紙上顯色后，在紫外燈下觀察有無黃綠色熒光的方法檢測監(jiān)控，提取至流洗液無黃酮反應時結束；將正丁醇提取液濃縮后揮干溶劑，用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺樹脂柱，依次用水和95%的乙醇洗脫，收集95%的乙醇洗脫液；洗脫至檢測無黃酮反應時結束；濃縮95%的乙醇洗脫液，自然干燥，揮干溶劑后得到的成分即為總黃酮成分。紫外分光光度測定其總黃酮含量為98.52%。1.3  試劑RPMI1640（GIBCO公司）；胎牛血清（HyClone公司）；小牛血清（HyClone公司）；Heper's（HyClone公司）；臺肦藍，MTT，LPS，SDS，ConA，瓊脂糖均為Sigma公司；RPM

9、I1640培養(yǎng)液；谷氨酰胺，青霉素，慶大霉素，Tris Base，a甲基甘露糖苷（amm）。1.4 儀器酶標儀（Bio-Rad，Model 3550）；離心機（北京醫(yī)用離心機廠，LDZ52）；倒置顯微鏡（Nikon DEAPHOT Fx35DX）；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（BNA311，ESPEC）；電子恒溫水浴鍋（DK98I）；微量高速離心機（Jouan）；三恒電泳儀（ECP3000，北京市六一儀器廠）。2  方法2.1  造模方法昆明種小鼠，40只，體重1822g，雌雄各半，隨機分為空白組、模型組、大薊黃酮模型組?？瞻捉M和模型組用生理鹽水0.2 ml/10 g體重灌胃，大薊總

10、黃酮模型組用大薊總黃酮0.2 ml/10 g體重灌胃，劑量為50 mg/kg，1次/d，連續(xù)10 d。第8天模型組和大薊黃酮模型組腹腔注射環(huán)磷酰胺55 mg/kg，0.1 ml/10 g，連續(xù)3 d。2.2  大薊黃酮對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IL-1的影響2.2.1  IL1樣品的制備供試小鼠以頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡5 min，用預冷的DHank's液5 ml注射入小鼠腹腔，輕揉數(shù)10次，充分洗出腹腔細胞，2 000 r/min離心10 min，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌兩次，用含5%小牛血清的RPMI1640調(diào)細胞數(shù)至2×106/ml加入24孔

11、細胞培養(yǎng)板中貼壁2 h。棄上清液，洗滌細胞，去除非粘附性細胞。加入10 g/ml的LPS和含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37，5%CO2潮濕大氣中溫育48h；收集上清液，-20保存，即為IL1待測樣品，收集細胞，提取RNA。2.2.2  IL1樣品的檢測以C57BL/6J純種小鼠胸腺細胞作為檢測IL1的靶細胞。供試小鼠以頸椎脫臼法處死，無菌取胸腺，用滅菌玻璃注射器芯擠壓過200目鋼絲網(wǎng)，2 000 r/min離心10 min，洗滌兩次，臺肦藍染色，計活細胞數(shù)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)至1×106/ml，將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每

12、孔100l（1×105個細胞）。用RPMI-1640培養(yǎng)液以1/4，1/8，1/32比例稀釋IL-1待測樣品，每孔加50l稀釋液，每個稀釋度設3個復孔。每孔加入亞劑量有絲分裂原ConA至終濃度為2g/ml。每孔總容量為200 l。在37，5%CO2潮濕大氣中培養(yǎng)48 h。用MTT比色法測定結果。2.3 大薊總黃酮對小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IL2的影響2.3.1  IL2樣品的制備供試小鼠以頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌取脾，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌，在200目鋼絲網(wǎng)上剪碎，用滅菌玻璃注射芯輕磨、過濾，分別制成脾細胞懸液，0.83%TrisNH4Cl破壞紅細胞，冰浴靜置10