Toll樣受體基因多態(tài)性和兒童特應(yīng)性疾病的相關(guān)性研究

1、Toll樣受體基因多態(tài)性和兒童特應(yīng)性疾病的相關(guān)性研究一、 項(xiàng)目研究意義特應(yīng)征（atopy）又稱異位性，是上世紀(jì)初葉Coca和Cooke命名的。特應(yīng)征的定義各種各樣，目前認(rèn)為它是一種IgE介導(dǎo)的異常的特異性免疫反應(yīng)。特應(yīng)性疾病（atopic diseases）是指由上述反應(yīng)引起的各種慢性皮膚和呼吸道疾病，包括特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性哮喘等，它們共同的特點(diǎn)是皮膚過敏原試驗(yàn)陽性，血清總IgE和特異性IgE升高。近年的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示特應(yīng)性疾病的發(fā)生率在上升，尤其在兒童或青少年中更為明顯。以哮喘為例，我國大約有1000萬兒童哮喘患者。全國兒科哮喘防治協(xié)作組于2000年進(jìn)行了第二次全國城市兒童

2、哮喘患病率抽樣調(diào)查顯示，全國兒童哮喘患病率為1.97，比1990年第一次哮喘流調(diào)時(shí)增加了近1倍。1990年我省的兒童哮喘現(xiàn)患率為6%，累計(jì)發(fā)病率為1.16%，而2000我省的兒童哮喘現(xiàn)患率為1.44%，累計(jì)患病率為2.14%，無論是現(xiàn)患率還是累計(jì)患病率均較10年前有大幅上升。特應(yīng)性疾病發(fā)病率的上升給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，仍以哮喘為例，哮喘患兒中，有5.64的學(xué)齡兒童不能上體育課，1年內(nèi)因病假缺勤的占了42.47。有95.47的患兒家長(zhǎng)因?yàn)楹⒆踊枷构ぷ魇艿接绊?，其中每年耽誤10天以上的占到62.27。因此，特應(yīng)性疾病不僅是21世紀(jì)亟待攻克的醫(yī)學(xué)問題，也已成為亟需解決的社會(huì)問題。特應(yīng)性疾病

3、有強(qiáng)烈的家族傾向，一組對(duì)大學(xué)生的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：當(dāng)一級(jí)親屬中沒有一個(gè)患特應(yīng)性疾病時(shí)，特應(yīng)性疾病的患病率為15%；當(dāng)其中一個(gè)一級(jí)親屬具特應(yīng)征，特應(yīng)性疾病的患病率為33%，如兩個(gè)或以上一級(jí)親屬具特應(yīng)征，則其患病率為68%。另一組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，父母均無特應(yīng)性疾病，小兒特應(yīng)性疾病的患病率為10%，父母之一具特應(yīng)征，小兒特應(yīng)性疾病的患病率為40%，如果父母雙方均具特應(yīng)性，則小兒特應(yīng)性疾病患病率為60%-80%，可見特應(yīng)性疾病受遺傳的強(qiáng)烈影響。隨著人類基因組計(jì)劃的開展，已有越來越多的學(xué)者關(guān)注特應(yīng)性疾病和基因的關(guān)系。近10年來的研究發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性疾病是個(gè)多基因遺傳病，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)和特應(yīng)征相關(guān)的基因位點(diǎn)，不同人種存在種族

4、差異性。根據(jù)研究結(jié)果篩選出特應(yīng)征基因攜帶者，有助于特應(yīng)征的早期診斷和干預(yù)，減少特應(yīng)性疾病的發(fā)生。特應(yīng)性疾病的發(fā)生是多種危險(xiǎn)因子相互作用的結(jié)果，包括遺傳易感性、暴露于變應(yīng)原的時(shí)間和數(shù)量以及非特異性的“佐劑”因子如空氣污染等。過去10年中，一些社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況良好的國家哮喘和過敏性疾病的發(fā)病增加，難以完全用遺傳背景的改變解釋。令人感興趣的是在歐洲和北美有許多關(guān)于農(nóng)村兒童和成人特應(yīng)性疾病發(fā)病率低的報(bào)道。因?yàn)樵谵r(nóng)村的動(dòng)物上檢測(cè)到大量的微生物，因此人們認(rèn)為早期暴露于微生物的產(chǎn)物可使個(gè)體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，使Th2向Th1轉(zhuǎn)變，從而減少特應(yīng)性疾病的發(fā)生，相反兒童在免疫成熟期處于“清潔”的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致Th2表達(dá)增加，增

5、加特應(yīng)性疾病的機(jī)會(huì)，這就是衛(wèi)生學(xué)說（hygiene hypothesis）的由來。盡管有這樣的發(fā)現(xiàn)，但是其機(jī)制尚不清楚。內(nèi)毒素和LPS是G-桿菌細(xì)胞的外層成分。模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別內(nèi)毒素，通過內(nèi)毒素受體復(fù)合體（包括LBP、CD14、MD2、TLR）激活固有免疫系統(tǒng)。固有免疫反應(yīng)是抵御感染的一道強(qiáng)有力的早期屏障，在感染的最初幾小時(shí)內(nèi)，它可以識(shí)別不同種類的病原細(xì)菌、病毒和真菌，并且對(duì)于激發(fā)晚一步啟動(dòng)的獲得性免疫反應(yīng)也至關(guān)重要。而Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）家族是觸發(fā)固有免疫反應(yīng)的關(guān)鍵所在，因此人們

6、對(duì)Toll樣受體的研究成為固有免疫研究的熱點(diǎn)之一。TLRs在抗原遞呈細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和其他細(xì)胞表面表達(dá)在環(huán)境和免疫系統(tǒng)的相互作用中起關(guān)鍵作用，這些細(xì)胞分泌的信號(hào)調(diào)節(jié)CD4+、CD8+細(xì)胞的成熟，這種成熟決定了對(duì)環(huán)境變應(yīng)原的獲得性免疫反應(yīng)。因此認(rèn)為TLR的基因變異會(huì)對(duì)免疫反應(yīng)類型產(chǎn)生影響，也會(huì)影響特應(yīng)性疾病的發(fā)生。Toll樣受體家族到目前為止共發(fā)現(xiàn)10類受體?，F(xiàn)被命名為TLR4的第一個(gè)哺乳動(dòng)物TLR于1997年由耶魯大學(xué)的Janeway和Medzhitov發(fā)現(xiàn)，TLR4被G-細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分脂多糖（LPS）激活，還可識(shí)別其他細(xì)菌的PAMPs，同時(shí)又能介導(dǎo)呼吸道合胞病毒（RSV）的固有免疫。

7、目前研究標(biāo)明TLR4基因在9q32-33,SNP分析發(fā)現(xiàn)896A/G導(dǎo)致Asp299/Gly，通過減少氣道上皮TLR4密度、減少炎癥細(xì)胞因子的分泌使機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)性下降，從而增加特應(yīng)性疾病的發(fā)生。英國報(bào)道TLR4基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)生無關(guān)，卻影響特應(yīng)征的嚴(yán)重程度。也有研究發(fā)現(xiàn)在高度暴露于內(nèi)毒素的兒童中TLR4/+4434和常見過敏原特異性IgE的關(guān)系，但盡管TLR4/+4434多態(tài)性和特異性IgE高度相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)其和哮喘和枯草熱之間明確的關(guān)系，因此可能有其他分子參與其中如MD2、CD14等。CD14是介導(dǎo)內(nèi)毒素細(xì)胞反應(yīng)的主要受體，是特應(yīng)性疾病的另一個(gè)候選基因，位于5q，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD14基

8、因多態(tài)性與IgE高水平密切相關(guān)。嬰幼兒期感染釋放內(nèi)毒素結(jié)合CD14受體，刺激Th1細(xì)胞因子表達(dá)，若存在CD14多態(tài)性，可使Th2表型持續(xù)表達(dá)。TLR2由阿拉伯甘露聚糖脂激活，這種糖脂是包括結(jié)核在內(nèi)的分支桿菌的細(xì)胞壁成分，也可由鉤端螺旋體屬細(xì)菌的LPS激活，其信號(hào)傳導(dǎo)途徑和TLR4相似。Eder W等研究發(fā)現(xiàn)TLR2/-16934的變異決定了農(nóng)村兒童哮喘和特應(yīng)征的易感性，并認(rèn)為TLR2是歐洲農(nóng)村兒童哮喘發(fā)病的主要候選基因。含有T等位基因能夠增加抗原遞呈細(xì)胞表面的TLR2表達(dá)減少哮喘和過敏性疾病的發(fā)生，反過來也增加表達(dá)于微生物產(chǎn)物的TLR2配體的保護(hù)作用。Hertz等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌脂肽可通過TLR2誘導(dǎo)

9、樹突狀細(xì)胞的成熟，使T細(xì)胞增值和IFN分泌能力大大提高，而TLR2的基因變異則會(huì)削弱這種功能，增加特應(yīng)性疾病的發(fā)生。TLR3基因位于4q35，能識(shí)別雙鏈病毒RNAs，有報(bào)道其和日本人群過敏性哮喘的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。TLR9則能識(shí)別主要存在與細(xì)菌DNA中的特殊序列CpG重復(fù)序列，而后者可刺激獲得免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，減少特應(yīng)性疾病的發(fā)生，Lazarus等報(bào)道TLR91237C/T多態(tài)性與歐洲美裔的哮喘發(fā)病有關(guān)。因此，研究Toll樣受體基因多態(tài)性和我省兒童特應(yīng)性疾病的相關(guān)性，闡明Toll樣受體在我省兒童特應(yīng)性疾病發(fā)病中的作用，對(duì)于我省兒童特應(yīng)性疾病的防治，增進(jìn)兒童健康具有十分重要的意義，也有利

10、于我省“和諧社會(huì)”的構(gòu)建。二、 項(xiàng)目研究目標(biāo)及與申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系 本項(xiàng)目是利用基因測(cè)序的方法，系統(tǒng)研究Toll樣受體家族的基因多態(tài)性，探討TLR4、TLR2、TLR3、TLR9、CD14基因多態(tài)性和我省兒童特應(yīng)性疾病之間的關(guān)系，尋找特應(yīng)性疾病的候選基因，利于早期診斷和干預(yù)特應(yīng)性疾病。 申請(qǐng)者所在的學(xué)科一直從事兒童哮喘和變態(tài)反應(yīng)性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。申請(qǐng)者的主要研究方向在兒童喘息性疾病和特應(yīng)征的關(guān)系及其早期診斷和干預(yù)，目前已完成“特應(yīng)征和呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎的關(guān)系”課題，發(fā)表數(shù)篇論文在各級(jí)雜志上，承擔(dān)的省教育廳課題“呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎氣道炎癥和預(yù)后的關(guān)系研究”也已取得

11、初步成果。 本項(xiàng)目小組長(zhǎng)期工作目標(biāo)是建立兒童特應(yīng)性疾病的基因診斷方法，尋找判斷兒童特應(yīng)性疾病預(yù)后的指標(biāo)，從而減少特應(yīng)性疾病的發(fā)生、改善預(yù)后。特應(yīng)性疾病的基因研究是全球變態(tài)反應(yīng)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，但目前有關(guān)中國兒童的資料很少。我國變態(tài)反應(yīng)專業(yè)仍在發(fā)展中，很多醫(yī)院尚未設(shè)立變態(tài)反應(yīng)科，過敏性鼻炎、過敏性哮喘和皮炎分別由耳鼻喉科、呼吸科和皮膚科醫(yī)生診治和管理。因此申請(qǐng)者在這方面的研究，有利于我省在變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)方向的發(fā)展。三、 項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排（一） 研究?jī)?nèi)容1、利用DNA測(cè)序法測(cè)定特應(yīng)性疾病兒童和正常對(duì)照兒童TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14等相關(guān)位點(diǎn)及其附近的核苷酸序列。

12、2、利用相關(guān)研究法觀察兒童特應(yīng)性疾病與TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14相關(guān)位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系。3、比較不同特應(yīng)性疾病相關(guān)位點(diǎn)核苷酸序列的差異。 4、發(fā)現(xiàn)中國特應(yīng)性疾病兒童特有的疾病相關(guān)多態(tài)位點(diǎn)。（二）研究方案和方法1、病例入選符合下列標(biāo)準(zhǔn)： 1）年齡012歲；2）臨床診斷為哮喘、過敏性鼻炎或特應(yīng)性皮炎；3）血清總IgE升高；4）皮膚過敏原試驗(yàn)陽性或血清特異性IgE升高。分別記錄年齡、性別、診斷、發(fā)病時(shí)間、家族特應(yīng)征史。其中哮喘組100例，過敏性鼻炎100例，特應(yīng)性皮炎50例。選取012歲正常體檢兒童100例為對(duì)照組，均不符合上述24項(xiàng)入選標(biāo)準(zhǔn)。 2、血清總IgE和特異性IgE測(cè)定

13、采用瑞典法碼西亞公司UniCAP系統(tǒng)，皮膚過敏原皮試采用德國阿羅格公司標(biāo)準(zhǔn)變應(yīng)原。 3、樣品采集和模板提?。翰裳?ml，酚氯仿抽取法提取血液白細(xì)胞總DNA ，700冰箱凍存。 4、PCR反應(yīng)：從Genbank下載基因組序列，參考文獻(xiàn)并用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，按有關(guān)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)。序列比對(duì)采用Blast軟件。引物由華大基因上海鼎安生物公司合成。 5、用WizardR PCR Preps DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。6、測(cè)序和分析：利用ABI PRISM377平板凝膠測(cè)序儀，采用PCR雙脫氧法測(cè)序，用有關(guān)程序進(jìn)行核酸序列多態(tài)性分析。測(cè)序在杭州華大基因研發(fā)中心進(jìn)行 。7、統(tǒng)計(jì)方法：用2

14、檢驗(yàn)分析兩組等位基因和基因型頻率以及Hardy-Weinberg吻合度，不同基因型總IgE濃度用方差分析，比較雙側(cè)進(jìn)行。（三）技術(shù)路線012歲兒童，收集臨床資料，測(cè)定SPT、血TIgE、SIgE ,收集標(biāo)本特應(yīng)性疾病組正常對(duì)照組特應(yīng)性皮炎過敏性哮喘組過敏性鼻炎提取白細(xì)胞DNAPCR擴(kuò)增及純化DNA序列測(cè)定及分析TLR3TLR2TLR9CD14TLR4統(tǒng)計(jì)分析、撰寫論文（四）關(guān)鍵技術(shù)1、確保樣本的代表性，入選病例必須符合本研究的要求。2、設(shè)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)PCR反應(yīng)的特異性引物，使PCR反應(yīng)產(chǎn)物盡可能長(zhǎng)一些，以獲取更多的序列信息，提高測(cè)序效益。（五）進(jìn)度安排2006年1月2006年12月 收集樣本、提

15、取DNA、設(shè)計(jì)引物2007年1月2007年6月 PCR擴(kuò)增、測(cè)序、分析2007年7月2007年12月 資料總結(jié)、論文撰寫、成果鑒定四、 項(xiàng)目創(chuàng)新之處 由于地域、種族、國度的不同，不同的人群中基因多態(tài)性的研究會(huì)有不同的結(jié)果，而目前國內(nèi)沒有有關(guān)Toll樣受體基因多態(tài)性和我國兒童特應(yīng)性疾病關(guān)系的研究，因此本研究對(duì)于了解我國兒童ToLL樣受體基因多態(tài)性有十分重要的意義。其創(chuàng)新點(diǎn)在于：（1）首次研究中國兒童ToLL樣受體基因多態(tài)性和兒童特應(yīng)性疾病的相關(guān)性。（2）利用基因測(cè)序的方法研究多態(tài)性，可能發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點(diǎn)。（3）比較不同特應(yīng)性疾病基因多態(tài)位點(diǎn)的區(qū)別，可以分析不同疾病的發(fā)病機(jī)制。五、 工作基礎(chǔ)與工作

16、條件申請(qǐng)者所在學(xué)科是國家首批擁有碩士學(xué)位授予單位。1997年被列入浙江省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)，2000年經(jīng)省衛(wèi)生廳驗(yàn)收合格授牌并被評(píng)為優(yōu)秀省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科。學(xué)科20多年來致力于小兒呼吸疾病的基礎(chǔ)及臨床研究，成果豐碩，特別在小兒毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)理及其與哮喘的關(guān)系領(lǐng)域，達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平，在國內(nèi)享有較高聲譽(yù)。本學(xué)科主攻方向是兒童哮喘和變態(tài)反應(yīng)性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。學(xué)科擁有專科病房40余張，病房年住院人次達(dá)1000人次以上，年門診病人1.5萬，有足夠的病例保證。項(xiàng)目小組是一個(gè)臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究相結(jié)合的工作小組，目前正承擔(dān)國家和省自然科學(xué)基金研究。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人目前正主持廳局級(jí)課題2項(xiàng)，項(xiàng)目主要成員曾經(jīng)參加

17、國家重大課題“人類基因組計(jì)劃1項(xiàng)目”和“水稻基因組計(jì)劃”，并完成中科院重大課題“騰沖嗜熱厭氧菌全基因組序列分析”，把基因組學(xué)和生物信息學(xué)兩個(gè)學(xué)科結(jié)合起來，為國家首次獲得了一張?jiān)松锶蚪M序列圖譜，填補(bǔ)了我國在此研究領(lǐng)域的空白，該研究成果對(duì)我國生命科學(xué)研究的發(fā)展具有重要的意義，達(dá)到世界先進(jìn)水平。目前已收集符合本研究標(biāo)準(zhǔn)的病例標(biāo)本150例，完成TLR4和CD14的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增，確定了DNA提取方法和PCR擴(kuò)增條件。正在進(jìn)行TLR2、TLR3、TLR9的序列比對(duì)和引物設(shè)計(jì)。學(xué)科有專用實(shí)驗(yàn)室200m2，具備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)條件，擁有PCR擴(kuò)增儀、紫外分光光度計(jì)、生物圖像分析儀、超低溫冰箱、超

18、低溫離心機(jī)、特異性變應(yīng)原測(cè)定UniCAP系統(tǒng)等設(shè)備。基因測(cè)序由杭州華大基因研發(fā)中心承擔(dān)。六、 預(yù)期研究結(jié)果及其利用研究結(jié)果的計(jì)劃和今后發(fā)展的思路預(yù)期研究結(jié)果包括（1）Toll樣受體基因多態(tài)性和兒童特應(yīng)性疾病的發(fā)生有關(guān)。（2）不同特應(yīng)性疾病可能有不同的多態(tài)位點(diǎn)。（3）研究結(jié)果將以論文發(fā)表，在國內(nèi)核心期刊和國外雜志發(fā)表35篇，并以科研成果爭(zhēng)取省級(jí)以上科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)。 將利用研究結(jié)果（1） 利用研究成果設(shè)計(jì)PCR試驗(yàn)，檢測(cè)Toll樣受體多態(tài)位點(diǎn)。（2） 用于臨床兒童特應(yīng)性疾病的診斷和鑒別診斷。今后發(fā)展思路過度的Th2免疫應(yīng)答是特應(yīng)性疾病的主要發(fā)病機(jī)理，調(diào)控Th1/Th2間的平衡是治療特應(yīng)性疾病的有效途徑

19、。有學(xué)者提出，前生命期處理誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答可以減少哮喘的發(fā)生。研究顯示，TLR9在CpG刺激后可抑制Th2免疫應(yīng)答并促使向Th1轉(zhuǎn)變。CpG及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-10調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡被認(rèn)為是特應(yīng)性疾病的特效治療方案。由于免疫應(yīng)答向Th1轉(zhuǎn)變也可增加氣道的炎癥反應(yīng)，故在早期天然免疫中產(chǎn)生抗炎反應(yīng)是預(yù)防特應(yīng)性疾病的有效方法。 此外，早期接觸感染原也會(huì)通過TLR4、TLR2調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡從而減少特應(yīng)性疾病發(fā)生。本研究將提供各類特應(yīng)性疾病的TLRs基因型，在本研究基礎(chǔ)上將繼續(xù)開展特應(yīng)性疾病發(fā)病機(jī)理和早期干預(yù)措施的研究，在特應(yīng)性疾病中將有廣闊的應(yīng)用前景。七、 主要參考文獻(xiàn)1、Noguchi

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