雙向電泳所需試劑

1、用戶需要準(zhǔn)備事項(xiàng)1. 確定電源接地2. 單蒸水3. 操作環(huán)境：15 £0 °C ±2 °4. 操作環(huán)境濕度要求：相對(duì)濕度0-70%*5. 大量筒或燒杯1L, 500ml,250ml,50ml6. 去離子水或MilliqQ水7. 提前購(gòu)置染膠的盒子30X 20cm,最好有蓋子如需實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備樣品和如下試劑。附錄I溶液涉注意請(qǐng)按照實(shí)驗(yàn)所需量酌量或減量配制A. 雙向電泳的樣品裂解溶液含有尿素8 M尿素，4% CHAPS 2%兩性載體Pharmalyte或IPG緩沖液載體兩性電解質(zhì)，40 mM DTT, 25 ml 最終濃度用量尿素(FW 60.06)8 M12

2、gCHAPS4% (w/v)1.0 g兩性載體Pharmalyte 或IPG緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)加2% (v/v)500 dDTT (FW 154.2)40 mM154 mg雙蒸水一至25 ml 需要水約16ml分裝為1.0 ml溶液儲(chǔ)存于-20 C條件下。IPG buffer和DTT現(xiàn)用現(xiàn)加。酌情增減使用量，每個(gè)樣品使 用約1ml.本次培訓(xùn)需要5mlB. 尿素水化儲(chǔ)藏溶液8 M尿素，2% CHAPS 0.5/2% 兩性載體 Pharmalyte 或 IPG緩沖液，0.002%溴酚藍(lán),25 ml *最終濃度用量尿素(FW 60.06)8M12gCHAPS2%(w/v)0.5g兩性載體Pharmalyt

3、e或IPG緩沖液與IPG膠條的范圍相同現(xiàn)用現(xiàn)加0.5%(v/v)125 d1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)藏溶液0.002%50 d雙蒸水一至25ml需要水約16ml分裝為1.0ml溶液儲(chǔ)存于-20 C條件下。每個(gè)樣品使用約1ml.本次培訓(xùn)需要5ml使用前參加DTT和IPG buffer ，每1.0ml水化儲(chǔ)藏溶液中參加 2.8mgDTT>載體兩性電解質(zhì)或IPG緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)加。C. SDS平衡緩沖液(6 M 尿素，75 mM Tris-HCl pH8.8,29.3% 甘油，2%SDS,0.002% 溴酚藍(lán)，200ml)*最終濃度用量尿素(FW 60.06)6 M72.1 gTris-HCl, pH 8.8

4、(參見(jiàn)溶液F局部75 mM10.0 ml甘油(87% w/w)29.3% (v/v)69 ml (84.2 g)SDS (FW 288.38)2% (w/v)4.0 g1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)藏溶液0.002% (w/v)400 4雙蒸水一至 200 ml這是儲(chǔ)藏溶液。在使用之前，按照一定量參加1%DTT 100mg/10ml 或2.5%碘乙酰胺250mg/10ml,分別用于第一次和第二次平衡。Ma用量10ml/膠條。分裝為20或50ml溶液儲(chǔ)存于-20 C條件下。本次培訓(xùn)需要100mlD. 10 x Laemmli SDS電泳緩沖液250 mM Tris 堿，1.92M甘氨酸，1% SDS 10L*最終

5、濃度用量Tris 堿(FW 121.1)250 mM303 g甘氨酸(FW 75.07)1.92 M1441 gSDS (FW 288.38)1% (w/v)100 g雙蒸水一至10L不要調(diào)節(jié)該溶液的pH值。室溫條件下儲(chǔ)存。根據(jù)不同型號(hào)二向電泳槽，根據(jù)電泳槽規(guī)格每次實(shí)驗(yàn)用量1x Laemmli SDS電泳緩沖液1-10L。本次培訓(xùn)配制1L,用量分別為T(mén)ris 30.3g, 甘氨酸144.1g, SDS 10g,溶解在1L水里E. 30% T, 2.6% C 單體儲(chǔ)液30%丙烯酰胺，0.8% N, N '-甲叉雙丙烯酰胺，500ml最終濃度用量丙烯酰胺FW 71.0830%150 gN,

6、N'-甲叉雙丙烯酰胺(FW 154.17) 0.8%4 g雙蒸水一至 500mL用0.45卩m濾膜過(guò)濾溶液，4 C避光儲(chǔ)存F. 4 X別離膠緩沖液(1.5M Tris 堿，pH8.8, 500mL)最終濃度用量Tris 堿(FW 121.1)1.5 M90.8g雙蒸水375 mlHCl一調(diào)至pH8.8雙蒸水一至 500mL用0.45卩m濾膜過(guò)濾溶液，4C存儲(chǔ)。G.溴酚藍(lán)儲(chǔ)藏溶液最終濃度用量溴酚藍(lán)1%100 mgTris-堿50 mM60 mg雙蒸水一至 10 mLH. 10% SDSS 液(10% SDS, 50 ml)最終濃度用量SDS (FW 288.38)10% (w/v)5.0

7、 g雙蒸水一至 50 ml用0.45卩m濾膜過(guò)濾溶液，室溫存儲(chǔ)I. 10%過(guò)硫酸銨溶液10%過(guò)硫酸銨,10 ml和1 ml最終濃度10 ml的用量1 ml的用量過(guò)硫酸銨(FW 228.20)10% (w/v)1.0 g0.1 g雙蒸水至 10 ml至1 ml新鮮的過(guò)硫酸銨在參加水時(shí)發(fā)出“劈啪聲，假設(shè)沒(méi)有聲音，請(qǐng)更換過(guò)硫酸銨。在用前配 制。J.瓊脂糖密封液25mM Tris 堿，192mM甘氨酸，0.1% SDS, 0.5% 瓊脂糖，0.002% 溴酚藍(lán),10ml最終濃度用量Laemmli電泳緩沖液見(jiàn)10 ml溶液D瓊脂糖NA或M0.5%0.05 g1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)藏溶液0.002% (w/v)20

8、 d將所有成分參加到100ml的燒瓶中。輕輕地?fù)u晃，使成分混勻。加熱直至瓊脂糖完全溶 解。不要讓溶液爆沸。以1.5ml為單位分裝至帶有螺旋帽的管內(nèi)，室溫保存。用量50 mlK.水飽和正丁醇n, i, or t- buta nol 50 mlDistilled or dei oni zed water10mlComb ine in a bottle and shake,use the top phase to overlay gels. Store at room temperature in defi nitely.配12%的別離膠,按下表參加各組分。一塊膠需50ml膠液，兩塊膠需90ml膠液。12%SDS-PAGE (單位：ml)510152025304050水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2468101216201.5 mol/L Tris (pH8.8)1.