PCR和ELISA在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

1、PCR 和 ELISA 在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用摘要 闡述了 PCR和ELISA這兩種技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的研究，并對(duì)這兩種方法特點(diǎn)與應(yīng)用進(jìn)行了探討。關(guān)鍵詞 PCR; ELISA ;致病菌檢測(cè)中圖分類號(hào) TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-57392008)09-0182-03近幾年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所對(duì)全國(guó)部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水產(chǎn)品、蔬菜中的 致病菌污染狀況進(jìn)行了連續(xù)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，微生物 源性食物中毒占居首位， 高達(dá) 39621 。隨著食品工業(yè)的 發(fā)展以及對(duì)食品安全的重視，傳統(tǒng)分析方法已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足 食品檢測(cè)的需要，迫切需要靈敏度

2、更高、特異性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便 快捷的食品安全檢測(cè)技術(shù)和方法。因此，近年來(lái)世界各國(guó)的 許多機(jī)構(gòu)和學(xué)者都致力于快速檢測(cè)技術(shù)和方法的研究，改進(jìn) 和開(kāi)發(fā)了一些快速的檢測(cè)技術(shù)和方法。其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA )以其簡(jiǎn)便、快速、 靈敏、成本低、檢測(cè)譜廣等特點(diǎn)在食源性致病菌檢測(cè)方面的 應(yīng)用也越來(lái)越受到人們的青睞。1PCR 技術(shù)PCR 技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也稱無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng)，是1985 年誕生的一項(xiàng) DNA 體外擴(kuò)增技術(shù)， 該技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)， 就以驚人的速度廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域。目前在 食品工程領(lǐng)域中致病微生物、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)等方面的應(yīng) 用也越來(lái)越受關(guān)注。1.1PCR

3、 技術(shù)原理PCR 是在體外合適條件下，以單鏈 DNA 為模板，以 1對(duì)人工合成的寡核苷酸為引物，在熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶作用特異性擴(kuò)增 DNA 片段的技術(shù)。 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程通常由 2040個(gè) PCR 循環(huán)組成，每個(gè) PCR 循環(huán)包括高溫變性低溫復(fù)性 適溫延伸 3 個(gè)步驟。方法是：首先將靶 DNA 雙鏈加熱變性 為單鏈，然后加入 2 段人工合成的與靶 DNA 兩端鄰近序列 互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為引物，即左端引物和右端引物；該 對(duì)引物與互補(bǔ)的 DNA 單鏈堿基互補(bǔ)結(jié)合后， 在有 DNA 聚合 酶和 4 種 dNTPs 底物存在的情況下， 引物沿模板 DNA 鏈（靶DNA單鏈）按5 末端向3末端方向延

4、伸，自動(dòng)合成新的DNA 雙鏈，新合成的 DNA 雙鏈又可作為擴(kuò)增的模板，繼續(xù) 重復(fù)以上的DNA聚合酶反應(yīng)。經(jīng)過(guò)2040次循環(huán)，可將靶DNA 序列擴(kuò)增近百萬(wàn)倍。1.2PCR 技術(shù)在食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用利用 PCR 檢測(cè)食品中的致病菌，首先要富集細(xì)菌細(xì)胞，通常經(jīng)離心沉淀、濾膜過(guò)濾等方法可從樣品中獲得細(xì)菌細(xì) 胞，然后裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的 DNA 釋放，純化后經(jīng) PCR擴(kuò)增細(xì)胞靶 DNA 的特異性序列，最后用電泳法或特異性核 酸探針檢測(cè)擴(kuò)增的 DNA 序列。1.2.1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)。 單核細(xì)胞增生李斯特菌( Listeria monocytogenes ， LM )是食品衛(wèi)生中的重要

5、病原菌，多通過(guò)食品經(jīng)口感染，被列為 20 世紀(jì) 90 年代食品中的四大病原菌之一。過(guò)去對(duì)食品中LM 進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，克隆培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法需要 34周的時(shí)間才能得出結(jié)果。國(guó)外已廣泛將 PCR 技術(shù)用于快速鑒定單核細(xì)胞增生李斯特菌， 國(guó)內(nèi) 的報(bào)道也不少。楊百亮等( 1994)通過(guò)條件優(yōu)化，建立了快速檢測(cè)牛奶中單核細(xì)胞增生李斯特菌的試劑盒 2 ，并在同年 報(bào)道了以I對(duì)位于該菌P -溶血素基因內(nèi)的26bp寡核苷酸為引物，用 PCR 對(duì)市售豬肉和牛奶中的單核細(xì)胞增生李斯特菌 的檢測(cè)3。金大智等運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光 PCR ( Real-time PCR)技術(shù)建立對(duì)食品中單增李氏菌進(jìn)行檢測(cè)的快速方法，設(shè)計(jì)的引 物和探針

6、的序列特異性強(qiáng)，省去凝膠電泳的繁瑣，降低了污 染的可能性。對(duì) 26種病原菌進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果表明，用實(shí)時(shí)熒光 PCR 法檢測(cè)單核細(xì)胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感， 特異性更高。1.2.2 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。金黃色葡萄球菌腸毒素(SE )可引起人類中毒，其內(nèi)毒素中毒休克綜合癥毒素ETA、(TSST1 )可引起中毒休克綜合癥，產(chǎn)生的脫皮毒素(ETB )與一系列膿皰性葡萄球菌感染有關(guān)。金黃色葡萄球菌 腸毒素是一種可溶性耐高熱蛋白，根據(jù)血清型別不同，分為A、B、C、D 和 E 等 5 個(gè)型。所有的金黃色葡萄球菌腸毒素 都有一個(gè)相同的基本結(jié)構(gòu)即含有二硫鍵和單一多肽鏈。其中 腸毒素D ( SED)的基因位

7、于質(zhì)粒上，由 256個(gè)氨基酸殘基組成，基因長(zhǎng)為 774 個(gè)堿基對(duì)，已全部定位。目前金黃色葡 萄球菌腸毒素 D 的鑒定主要是依賴于免疫學(xué)技術(shù)， 該技術(shù)需 要細(xì)菌純培養(yǎng)和制備腸毒素，試驗(yàn)周期長(zhǎng)、步驟繁多，使其 在食品衛(wèi)生學(xué)鑒定時(shí)受到限制， 近年來(lái) PCR 技術(shù)的發(fā)展為食擇SED基因的第360381對(duì)堿基為上游引物，第 654 675品病原微生物的鑒定提供了新的途徑。云泓若等(1999)選對(duì)堿基為下游引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出SED基因的316bp 長(zhǎng)的 DNA 片段，并建立了直接利用細(xì)菌裂解液作為模板的PCR 方法 4。1 .2.3沙門氏菌的檢測(cè)。 Nguyen 等根據(jù)腸炎沙門氏菌 c7克隆株具有

8、的屬特異性序列( 2.1kb HindIII 片段)設(shè)計(jì)出 1對(duì)引物，能快速地檢測(cè)出肉食品標(biāo)本中的沙門氏菌，檢測(cè)的 敏感性和特異性均為 100，這保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。沈孝民用 PCR 技術(shù)對(duì)各種不同血清型的沙門菌和已知被該菌污 染的魚(yú)粉和動(dòng)物產(chǎn)品的肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法特異性高，且靈敏、快速，并可在1d之內(nèi)完成5。1.2.4 致病性大腸桿菌的檢測(cè)。 腸毒素大腸桿菌 （ETEC）是引起嬰幼兒和幼畜腹瀉的主要病因之一。該菌可產(chǎn)生2種腸毒素：熱敏性腸毒素LT 和耐熱性腸毒素ST,它們均能弓起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)的代謝紊亂并導(dǎo)致腹瀉。ETEC 弓起的腹瀉主要是食入了被該菌污染的食品所致。

9、PCR 技術(shù)為臨床和實(shí)驗(yàn)室提供了一個(gè)更為快速靈敏的檢測(cè)手段。王嘉福等（1997）根據(jù)LT和ST基因序列，合成了引物，并對(duì)128份食品樣品中ETEC腸毒素基因（LT和ST）片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果共有15個(gè)樣品被檢出污染了 ETEC，并且證實(shí)用于擴(kuò)增的引物具有高度特異性6。盧林耿等（1999）用PCR法檢 測(cè)大腸桿菌 0157 的志賀樣毒素基因，試驗(yàn)表明弓物具有高 特異性 7 。1.3PCR 技術(shù)存在的主要問(wèn)題及展望旦有極1.3.1 污染問(wèn)題。 PCR 是一種極為靈敏的反應(yīng)，少量外源性 DNA 污染，就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，所以在操 作時(shí)必須加以注意。1.3.2 假陰性問(wèn)題。食品是復(fù)雜的反應(yīng)基質(zhì)，影響

10、PCR反應(yīng)的因素很多，如果不能有效排除各影響因素的干擾，很 可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 此外，如果在PCR操作過(guò)程中各種試 驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致產(chǎn)物突變，也會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié) 果。對(duì)于這些問(wèn)題必須有充分的考慮和排除措施。1.3.3 引物設(shè)計(jì)及靶序列選擇。 引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇是決定 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵因素， 引物不同則擴(kuò)增物不同， 果引物的設(shè)計(jì)不當(dāng)，則直接影響對(duì)關(guān)鍵靶序列的選擇，降低PCR 檢測(cè)的靈敏度和特異性，甚至完全失敗。因而，必須對(duì) 擴(kuò)增序列有充分的了解，并規(guī)范 PCR 實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù)。1.3.4PCR 技術(shù)應(yīng)用展望。盡管還存在著一定的問(wèn)題，但由于 PCR 技術(shù)可以快速特異地?cái)U(kuò)增任何期望

11、的DNA 片斷和目的基因，因而在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。相信隨著該技術(shù)的進(jìn)步普及、發(fā)展和完善， PCR 技術(shù)將會(huì)得到更加普遍地應(yīng)用和發(fā)揮更大的作用。2ELISA 技術(shù)ELISA 是一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。20 世紀(jì) 70年代初，由 Engvall 及 Van Weemen 等在放射免疫分析的基礎(chǔ) 上建立起來(lái)的一種非均相的酶免疫檢測(cè)技術(shù)。2.1ELISA 原理ELISA 的基本原理是預(yù)先結(jié)合在固相載體上的抗體或抗原分子與樣品中的抗原或抗體分子在一定條件下進(jìn)行免 疫學(xué)反應(yīng)，免疫復(fù)合物所攜帶的酶分子可將特定的底物分子 轉(zhuǎn)化為具有特定顏色的化合物，并由顏色的深淺反映樣品中 抗原或抗體分

12、子的量。該方法具有靈敏、特異、快速、穩(wěn)定 以及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。2.2ELISA 技術(shù)在食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用2.2.1 沙門氏菌的檢測(cè)。田銀芳等 8 應(yīng)用直接 ELISA 方法對(duì) 350 份奶樣進(jìn)行沙門菌的檢測(cè)。與常規(guī)方法相比，該方 法的敏感性和特異性分別為 100和 99.7。張艷紅等 9 則 利用單克隆抗體建立了一種競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法，與國(guó)標(biāo)法相比 靈敏性、特異性分別為 94.4和 97.7。楊靜等 10 利用 2株單抗建立的直接 ELISA 方法對(duì)沙門菌屬有高度的特異性， 且對(duì) A-F 群代表菌株的最小檢出量為 1 0cfu/L 。這充分展示ELISA 的特點(diǎn)，而且顯示出與國(guó)標(biāo)

13、法相比的優(yōu)勢(shì)。另外，還 有研究者將其他分離技術(shù)與 ELISA 結(jié)合起來(lái)以縮短檢測(cè)周 期和降低檢測(cè)限。 Mansfield LP 等11將免疫磁珠分離技術(shù)與ELISA 聯(lián)合起來(lái)建立一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)。 該系統(tǒng)對(duì)生雞肉和飼料的檢測(cè)限為2X 103cfu/25g，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)不足27h,其中包括 18h 傳統(tǒng)的前增菌和 6h 葡萄糖營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的樣品預(yù)處理過(guò)程；而傳統(tǒng)方法需要7296h。這對(duì)于快速檢驗(yàn)是個(gè)很好的嘗試。2.2.2大腸桿菌 0157的檢測(cè)。大腸桿菌 0157 也是嚴(yán)重危害人類身體健康的食源性致病菌，可導(dǎo)致人畜死亡。趙志晶等研究獲得了抗腸出血性大腸桿菌0157：H7 的多克隆抗體， 建立了用

14、于食品樣品檢測(cè)的雙抗 ELISA 檢測(cè)方法。 該方法對(duì) 純培養(yǎng)菌液檢測(cè)限為 103104cfu/mL ；只對(duì) 0157 菌株有特異性反應(yīng)，對(duì)非 0157 菌株無(wú)交叉反應(yīng)；經(jīng)過(guò)增菌，雞肉與 奶染菌樣品中的大腸桿菌 0157 的檢出下限均為 0.1cfu/gmL ）。 Norval JC 等 建立一種磁性微球結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)，可以在 3h 內(nèi)檢測(cè)到 103cfu/mL 的大腸桿菌 0157：H7 。這極大地縮短了檢測(cè)周期并降低了檢測(cè)限。 SongJM 等建立種 ELISA 為輔助的高通量生物芯片系統(tǒng)，該方法大腸桿菌細(xì)胞檢測(cè)限可達(dá) 3cfu/mL ，很大程度上提高了檢測(cè)速率，降 低了檢測(cè)勞動(dòng)強(qiáng)

15、度。近些年，隨著對(duì)檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)時(shí)間 要求的不斷提高， 人們又將 PCR 和 ELISA 方法結(jié)合到一起， 從而創(chuàng)造了 PCR-ELISA 技術(shù)。該技術(shù)是以 ELISA 特異性捕0157：獲的微生物為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 從而提高檢測(cè)靈敏度。 例 如， 2002年 Ge BL 等建立一種檢測(cè)食品中的大腸桿菌H7 和產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的 PCR-ELISA 方法。該方法可以 檢測(cè)到0. 1lO.Ocfu的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌和志賀毒素基因；還可以無(wú)需任何增菌即可在牛肉中檢測(cè)到 105cfu/g 的菌 體。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需要 6h,而且該方法適合于大規(guī)模監(jiān)測(cè)和未來(lái)的自動(dòng)化檢測(cè)。2.2.3 單核

16、細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)。 L monocytogenes是食源性致病菌中較為特殊的一種菌，該菌可以在食品低溫 儲(chǔ)藏過(guò)程中增長(zhǎng)而且還可以導(dǎo)致死亡，所以各國(guó)對(duì)其的檢測(cè) 顯得更為關(guān)注。 1999 年， Enne de Boer 等7利用所建立的ELISA 方法經(jīng)過(guò)前增菌后進(jìn)行 L. monocytogemes 檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)到 103105cfu/mL ，而且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需要 16 24h。但是，Sewelld AM等建立一種檢測(cè)食品中L monocytogenes 的高效快速的酶聯(lián)熒光檢測(cè)法，該方法的 菌體最佳檢測(cè)水平為 104105cfu/mL ,包括孵育在內(nèi)整個(gè)檢 測(cè)過(guò)程僅需要52h。與傳

17、統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法相比就大大縮短了 檢測(cè)時(shí)間，加快了檢測(cè)步伐。2.3ELISA 技術(shù)存在的主要問(wèn)題及展望2.3.1ELISA 技術(shù)存在的主要問(wèn)題。 首先該方法需要較多的儀器設(shè)備，如酶標(biāo)儀、恒溫箱及微量移液器等，不適宜基 層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；其次，該技術(shù)的操作技巧性較強(qiáng)而且對(duì)關(guān)鍵點(diǎn) 的控制對(duì)結(jié)果影響很大。 在 ELISA 方法中重要的是第一步加 樣，樣品加入及混勻過(guò)程的誤差會(huì)在以下的諸多操作中被逐 級(jí)放大，造成檢測(cè)結(jié)果偏差較大甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。而且， 操作過(guò)程中易出現(xiàn)孔間交叉污染， 出現(xiàn)假陽(yáng)性； 最后， 該方法檢測(cè)限較高，達(dá)到 106cfu/L9 。因此，解決以上問(wèn)題 將成為該技術(shù)的發(fā)展方向和推動(dòng)力。

18、2.3.2ELISA 技術(shù)展望。 單一的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)限較高是困擾該方法推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。為了解決這個(gè)矛盾， 許多學(xué)者把其他方法與免疫學(xué)方法結(jié)合起來(lái)以提高檢測(cè)靈 敏性，且大大縮短了樣品檢測(cè)周期。發(fā)明更靈敏的檢測(cè)方法 或者發(fā)現(xiàn)新的檢測(cè)靶位點(diǎn)也顯得非常重要。同時(shí)，如何完全 地釋放或暴露樣品中食源性致病菌的靶位點(diǎn)成為降低檢測(cè)限的一個(gè)突破口。研究開(kāi)發(fā)高效的樣品前處理方法便成為充分發(fā)揮免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)的前提，也是免疫學(xué)方法在食源性致病菌檢測(cè)中推廣應(yīng)用的重點(diǎn)。3 參考文獻(xiàn)1 唐福勇我國(guó)食品安全面臨考驗(yàn)主要是微生物污染N2 楊百亮,趙立平,史蘭琴,等快速檢測(cè)牛奶中單中國(guó)經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào)，2004-11-24

19、核細(xì)胞增多癥李氏菌 PCR 試劑盒的研制 J 中國(guó)公共衛(wèi)生，1994，10（7）：304-305.3 楊百亮，聶向庭，馬海利,等應(yīng)用 PCR 檢測(cè)單核細(xì)胞增多癥李氏菌的研究J.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1994, 25 (4):353-358.4 云泓若，李月琴，周天鴻 PCR 技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D基因J.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),999 ,20（ 5） ：84-87.5 沈孝民，涂書(shū)清用 PCR 技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物產(chǎn)品中沙門氏菌的研究 J中國(guó)動(dòng)物檢疫，1997，14（2）：8-10.6 王嘉福，冉雪琴，吳擁軍，等應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)食品中腸毒素大腸桿菌 J.食品科學(xué)，1997, 18 (1):43-45.7 盧林耿，衛(wèi)國(guó)榮，周曉明，等 PCR 法檢測(cè)大腸桿菌0157志賀樣毒素J.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999 , 26 （6）:451.8 田銀芳，王翌明 ELISA 方法與國(guó)標(biāo)法在檢測(cè)鮮奶中沙門氏菌的比較 J 中國(guó)乳品工業(yè)，1998，26（ 5）：32-33 9 張艷紅，杜元釗，吳延功腸炎沙門氏菌快速檢測(cè)方法的建立 J 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2002，19（7）：25-2810 楊靜，焦新安，文其