基于包被包膜糖蛋白抗體納米金磁性微粒的無試劑安培免疫傳感器

1、基于包被包膜糖蛋白抗體納米金磁性微粒的無試劑安培免疫傳感器    The best of friends must part.  There is more trouble in having nothing to do than in having much to do.                    作者：干寧 王魯雁 李天華

2、 鄭 磊 王 峰【摘要】  在玻碳電極(GCE)表面固定對(duì)H2O2有催化還原活性的富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅(GCE|CuL);再在GCE|CuL表面修飾一層金磁微粒殼聚糖復(fù)合膜(nano Au/Fe3O4/Chit), 進(jìn)而固定艾滋病毒(HIV)診斷標(biāo)志物包膜糖蛋白(gp160)抗體(anti gp160), 由此構(gòu)建了一類快速檢測(cè) gp160的無試劑安培免疫傳感器。當(dāng)該傳感器在含gp160溶液中37 下溫育30 min后, 傳感器表面生成的免疫復(fù)合物隨gp1

3、60濃度的增大而增加, 導(dǎo)致CuL 對(duì)H2O2 電催化還原效果降低, 催化電流呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在PBS溶液(pH 7.0)和-300 mV下, 催化電流的降低值Io與gp160濃度在1400 g/L 呈線性關(guān)系; 檢出限為0.5 g/L(3)。研制的免疫傳感器檢測(cè)gp160時(shí), 一步免疫反應(yīng)即可得結(jié)果, 較相同條件下包被gp160抗體的納米金單分子層修飾電極靈敏度更高, 檢測(cè)范圍更寬, 有望用于艾滋病人血清標(biāo)志物gp160快速篩測(cè)()。 

4、【關(guān)鍵詞】  富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅, 納米金, 磁性微粒, 殼聚糖, 艾滋病毒，包膜糖蛋白, 安培免疫傳感器Call no man happy until he dies.  1 引 言人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期檢出對(duì)杜絕艾滋病傳播極其重要, 常用的艾滋病診斷方式是抗體檢測(cè)1。在艾滋病毒感染早期, 人體內(nèi)尚未出現(xiàn)抗體(即 “窗口期”), 已具有很強(qiáng)的傳染性2。此時(shí)，“窗口期”HIV的診斷標(biāo)志物包膜糖蛋白抗原(gp160)已經(jīng)存在于人血清中,

5、60;但含量很低(<8 g/L), 若能對(duì)其檢測(cè)將有效縮短診斷“窗口期”3。目前, 主要采用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)痕量gp1603, 該法雖然結(jié)果準(zhǔn)確, 但是操作繁瑣、儀器昂貴, 限制了其推廣。電化學(xué)免疫分析具有操作簡便、樣品量少、快速靈敏等特點(diǎn), 已應(yīng)用于臨床檢測(cè)49。由于缺乏簡單而又能長期保持抗體生物活性的電極固定方法, 且通常需要在反應(yīng)體系中加入電子媒介體(eT)以加速電子傳遞, 導(dǎo)致基底干擾并使抗體失活, 限制了其應(yīng)用59。近年來, 通過在金膠等具有良好生物

6、兼容性的納米顆粒上包被抗體, 并將其與eT共固定到電極表面, 獲得了靈敏度高、無需外加eT、且抗體不易失活的無試劑安培免疫傳感器1014(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。He等9通過在電極表面的殼聚糖(Chit)膜上層層電沉積納米金, 包被癌胚抗原(CEA)抗體, 獲得了測(cè)定CEA的安培免疫傳感器。由于電極表面有多層納米金, 比單分子層納米金吸附更多抗體, 因此在檢測(cè)CEA時(shí)線性范圍更寬, 靈敏度更高。然而該電極檢測(cè)需在電解池中加鐵氰化鉀作eT, 體系復(fù)雜，易導(dǎo)致抗體失活, 且電極表面需多步納米修飾, 

7、;操作繁瑣。本研究組在單分散Fe3O4微粒表面負(fù)載納米金, 合成了nano Au/Fe3O4金磁性微粒12。在每個(gè)Fe3O4微粒表面包裹著多個(gè)納米金, 再接枝到電極表面形成單分子層將比單層納米金吸附更多抗體, 擴(kuò)展傳感器檢測(cè)范圍, 提高靈敏度。某些銅配合物具有催化H2O2活性, 可代替H2O2酶被修飾在電極表面制作H2O2傳感器15?；谝陨纤悸? 本實(shí)驗(yàn)合成了對(duì)H2O2具有催化活性的富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅(CuL)16, 將其與gp160抗體包被金磁微粒殼聚糖復(fù)合膜共固定在GCE上, 制備了gp160免疫

8、傳感電極, 并用于血清樣本檢驗(yàn)。        2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器與試劑CHI660B電化學(xué)分析工作站(上海辰華公司);三電極體系：GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(=2 mm)為工作電極, 鉑電極為對(duì)電極, 飽和甘汞電極為參比電極;Easysizer20激光粒度儀(美國歐美克公司);VF320型X射線熒光光譜儀(日本島津公司);PHI5400X射線光電子能譜儀(美國PE公司), 

9、;Hitachi X650掃描電鏡(日本Hitachi公司)。直徑50400 nm的Fe3O4微粒(美國Fluka公司);3巰丙基三乙氧基硅烷(95%)、殼聚糖(Chit, 脫乙酰度>90.0%)及AuCl3·HCl·4H2O購自上海國藥試劑公司。人抗人類免疫缺陷病毒抗體(HIV)ELISA試劑盒(美國ADL公司)：包括不同濃度(0500 g/L)的gp160抗原和單克隆gp160抗體(Anti gp160);牛血清蛋白(BSA, 96%99%)與人血清蛋白(HSA, 96%99%)購自美國Sigm

10、a公司。其它試劑均為分析純, 實(shí)驗(yàn)用水為超純水(美國Millipore純水器)。2.2 Nano Au/Fe3O4/Chit共聚物合成按文獻(xiàn)16合成富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅(Cu(bpy)2(H2O)2(C6H8O4)2(ClO4)4)。Nano Au/Fe3O4溶膠參考文獻(xiàn)1012合成, 用粒度分析儀和TEM測(cè)得金磁微粒直徑為(280±1.2) nm, 納米金粒徑為(30±1.7) nm, 濃度為5×107粒/mL。根據(jù)X射線能譜分析, 顆粒表面Au和Fe的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分

11、別為23.7%和40.2%, 估算出每個(gè)Fe3O4包被1020個(gè)金膠。Nano Au/Fe3O4/Chit溶膠參考文獻(xiàn)10方法制備：將1 mL Nano Au/Fe3O4溶膠與2 mL 0.1%殼聚糖0.05 mmol/L HAc混合，攪拌2 h, 在4 下放置過夜。2.3 GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 電極的制備和檢測(cè)將玻碳電極浸于1.0 mmol/L CuL二甲苯溶液

12、中,10 h后取出, 以二次蒸餾水反復(fù)沖洗去除電極表面雜質(zhì), 自然干燥, 制得 GCE|CuL 電極15。按照文獻(xiàn)9方法, 取10 L nano Au/Fe3O4/Chit溶液滴在GCE|CuL電極表面形成一層穩(wěn)定膜, 室溫晾干, 進(jìn)而將其浸入anti gp160溶液中于25 放置7 h, 即得GCE|CuL/nanoAu/Fe3O4/Chit/anti gp160免疫電極。再將此電極浸入5%BSA溶液中5 h,&#

13、160;封閉抗體未包被的電極表面, 制備過程見圖1。實(shí)驗(yàn)中始終維持N2氣氛。2.4 測(cè)定過程本免疫分析是基于免疫結(jié)合物的生成阻礙CuL與H2O2之間的電子傳遞而進(jìn)行測(cè)定。參照文獻(xiàn)14方法, 首先分別測(cè)定在5 mL 除氧的0.1 mol/L PBS 溶液(pH 7.0)和含1 mmol/L H2O2 的相同底液中, 免疫傳感器在-300 mV 下電解120 s時(shí)的安培響應(yīng)i0和iH。將免疫傳感器在含待測(cè)gp160的溶液中于37 

14、下溫育30 min, 在同樣條件下測(cè)定含1 mmol/L H2O2的PBS 溶液(pH 7.0)中的安培響應(yīng)i, 計(jì)算安培響應(yīng)的降低百分率100×(iH-i)/(iH-i0)。Riches do not always bring happiness.           3 結(jié)果與討論3.1 HIV免疫傳感器的表征None but a wise man can employ leisure wel

15、l.  采用交流阻抗譜對(duì)電極修飾過程進(jìn)行了表征。如圖2所示, 裸GCE上FeCN高頻區(qū)的Ret較小。隨著CuL, Chit, nano Au/Fe3O4/Chit膜不斷修飾到GCE后(圖2 bd), 高頻區(qū)半圓直徑不斷增大, 表明抗體修飾膜的形成阻礙了FeCN電化學(xué)反應(yīng)。 圖2 免疫傳感器制備過程中不同電極的交流阻抗圖Fig.2 AC impedance plot of(a) bare GCE(b) GCE|CuL(c)

16、60;GCE|CuL/Chit(d) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(e) the electrode of(d) closed by BSA in 5 mmol/L Fe(CN)3-/4-6+0.5 mol/L KCl solution. The frequency range was 0.1-1.0×105 Hz按內(nèi)容性

17、質(zhì)和研究方法的不同可以把論文分為理論性論文、實(shí)驗(yàn)性論文、描述性論文和設(shè)計(jì)性論文.  采用SEM對(duì)包被抗體前后的電極表面進(jìn)行了表征。圖3a顯示電極表面有許多白色亮點(diǎn), 推測(cè)是nano Au/Fe3O4反射形成的14;當(dāng) anti gp160 包被后, 電極表面形態(tài)發(fā)生了明顯變化, 出現(xiàn)了很多島型片狀物質(zhì), 推測(cè)是抗體固定在電極表面的形貌(圖3b)。圖3 (a) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit和已經(jīng)包被anti gp160電極(b)的掃描電鏡圖Fi

18、g.3 Scan electron microscopic images of GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit(a) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 electrode(b)采用X射線熒光光譜(測(cè)定元素范圍為9F92U)對(duì)免疫傳感電極表面進(jìn)行表征, 顯示了Cuk(峰(2=123.7)和Sk(峰(2=110.5), 由于gp160抗體富含甲硫氨基酸3, 說明CuL和anti&

19、#160;gp160被修飾到電極表面。對(duì)吸附了CuL的石墨片進(jìn)行了XPS分析, 932.7/954.3 eV處出現(xiàn)了Cu2+的特征峰Cu(2P3/2, 2P1/2), 表明銅離子為+2價(jià)。3.2 GCE|CuL和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4修飾電極的伏安行為Nature is the glass reflecting truth.  GCE|CuL修飾電極在PBS(pH 7.0)中的循環(huán)伏安曲線如圖4A所示。由圖4A(a)可知, 在掃描速度100 mV/s時(shí), CuL有一

20、對(duì)穩(wěn)定的氧化還原峰, 峰電位分別為14和-310 mV。在底液中加入1 mmol/L H2O2后, 還原峰增大而氧化峰減小(圖4A(b), 說明GCE|CuL可催化H2O2的還原。在GCE|CuL上修飾Fe3O4微粒后, 電極在PBS中的氧化還原電流顯著提高(圖4A(c), 而GCE|CuL修飾nano Au/Fe3O4后電流增強(qiáng)更明顯(圖4A(d)。God sends fortune to fools.  文獻(xiàn)17, 18報(bào)道納米Fe3O4和納米Au均有增強(qiáng)GCE表面電子傳遞功能,&

21、#160;并可提供抗體維持活性的微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者形成復(fù)合微粒后, 這種增強(qiáng)效應(yīng)具有可疊加性。GCE|CuL在50300 mV/s掃速范圍內(nèi), 陽極和陰極峰電流均隨掃速增大而增加, 并呈線性關(guān)系(圖4B), 表現(xiàn)出明顯的表面控制過程。由不同掃速下陰極與陽極峰的電位差可計(jì)算獲得該過程的平均電子傳遞速率為(1.57±0.12) s-1。CuL表面覆蓋度為(9.02±1.13)×10-10 mol/cm2, 這一數(shù)值相當(dāng)于電極表面覆蓋的為單分子層13。計(jì)算得反應(yīng)電子數(shù)n=1.772,&#

22、160;表明電極表面發(fā)生了Cu/Cu(0)的電子轉(zhuǎn)移。Silence in times of suffering is the best.  圖4 (A) GCE|CuL電極在0.02 mol/L PBS(pH 7.0)底液中(a)和加入1 mmol/L H2O2后(b);GCE|CuL/Fe3O4電極(c)和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 電極(d)在相同底液中的循環(huán)伏安圖; (B) GCE|CuL電極在不同掃速下的的循環(huán)伏安圖Fig.4 (A)

23、60;Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME not add(a) and added 1 mmol/L H2O2(b); GCE|CuL/Fe3O4(c) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 CME(d) in 0.02 mol/L PBS(pH 7.0) at scan rate of 1

24、00 mV/s. (B) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME at different scan rate, af: 50, 100, 150, 200, 250 and 300 mV/s, respectively. 插圖(Insert): ipv3.3 免疫傳感器的電化學(xué)行為及對(duì)gp160檢測(cè)圖5a為裸電極在底液中循環(huán)伏

25、安(CV)圖, 沒有任何電流響應(yīng)。圖5b為該免疫傳感器在底液中CV圖, 和相同掃速下的GCE|CuL相比(圖4a), 氧化峰電位正移而還原峰電位負(fù)移。由實(shí)驗(yàn)可知nano Au/Fe3O4, Chit, anti gp160均無電活性, 故氧化還原峰對(duì)應(yīng)于CuL的氧化還原反應(yīng)可逆性下降, 可歸因?yàn)镃hit和anti gp160均不導(dǎo)電且分子較大, 阻抗增加, 顯著阻礙了CuL的電子傳遞效率。當(dāng)在底液中加入1 mmol/L H2O2后, 還原峰增大,

26、 氧化峰減小, 峰電位不變(圖5c), 將電極在0.2% HSA中溫育后, 電流無明顯變化(圖5d), 表明其對(duì)非特異性蛋白吸附很小;而將電極在50 g/L gp160 溶液中溫育30 min后, 電流明顯減小(圖5e), 電流減少值i0和gp160的加入量呈正比。將該傳感器放入pH 4.0 8.0的PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)掃描, 電極的氧化還原峰電勢(shì)隨pH值的增加線性負(fù)移, 圖5 免疫傳感器測(cè)定gp160的循環(huán)伏安圖Fig.5

27、 Cyclic voltammograms of bare GCE(a), immunosensor(b), immunosensor(c), immunosensor after incubated with 0.2% HSA(d), and immunosensor after incubated with 50g/L gp160(e) at 100 mV/s&#

28、160;in pH 7.0 PBS containing 1 mmol/L H2O2Epa/pH=-52 mV/pH; Epc/pH=-54 mV/pH。由于CuL在電極反應(yīng)中的電子得失數(shù)為2, 推測(cè)每個(gè)配位的富馬酸含有2個(gè)COO-可得失H+。推斷檢測(cè)機(jī)理如圖6：CuL在電極上被還原為Cu(0)L, 溶液中的H2O2通過擴(kuò)散達(dá)到電極溶液界面, 將Cu(0)L氧化成CuL, 而自身被還原成H2O。當(dāng)gp160和anti gp160發(fā)生免疫結(jié)合后,&

29、#160;免疫生成物阻礙H2O2到達(dá)電極表面的傳質(zhì)過程, 電極催化H2O2電流下降。 論文教育信息網(wǎng)  3.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化優(yōu)化了CuL和抗體在GCE電極表面的修飾條件。GCE在1 mmol/L CuL中浸泡后, 電流在010 h內(nèi)不斷增加, 10 h后不再增加, 說明此時(shí)CuL在電極表面吸附基本飽和。將得到的GCE|CuL表面固定nano Au/Fe3O4/Chit膜, 并于25 在100 g/L gp160抗體(試劑盒中貯備液濃度

30、)溶液中浸泡, 07 h內(nèi)電流不斷下降, 7 h 后基本穩(wěn)定, 說明抗體在金膠上吸附飽和。因此CuL和gp160抗體的浸泡時(shí)間分別選擇10和7 h。圖6 免疫傳感器對(duì)gp160檢測(cè)原理示意圖First try, and then trust.  Fig.6 Procedure of immunosensor for gp160 detection免疫反應(yīng)受pH、H2O2、濃度、溫育時(shí)間等影響。考察了免疫傳感器在不同pH底液中對(duì)1.0 m

31、mol/L H2O2的催化響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn), 峰電流在pH 3.57.0逐漸增大;pH>7.0后, 峰電流開始減小。因此,最佳pH值選擇7.0。本傳感器對(duì)H2O2響應(yīng)迅速, 電流達(dá)到穩(wěn)態(tài)僅需2 s, 明顯快于納米金修飾電極10。H2O2濃度在0.11.0 mmol/L范圍內(nèi)與電流響應(yīng)呈良好線性關(guān)系;濃度再提高, 電流響應(yīng)改變不大。所以, 本實(shí)驗(yàn)采用1.0 mmol/L H2O2。隨著溫育時(shí)間的延長, 催化電流的下降值i0隨之增加, 當(dāng)達(dá)到30 

32、;min后趨于穩(wěn)定值, 說明此時(shí)電極表面免疫反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行完全。這比一般的酶聯(lián)免疫溫育時(shí)間(5060 min)縮短了2倍13, 這是因?yàn)楸痉椒ɑ谝淮涡悦庖叻治? 較夾心ELISA法減少了二抗的加入?？疾炝穗娢粚?duì)H2O2安培測(cè)定的影響, 當(dāng)電位在-150 mV附近時(shí), 就可以觀察到H2O2在電極表面的還原, 電位負(fù)移到-400 mV, 電流大幅度增大。這是因?yàn)殡娢辉截?fù), 對(duì)H2O2還原驅(qū)動(dòng)力就越大。當(dāng)電位為-300 mV時(shí), 安培響應(yīng)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)。所以本傳感器的最佳反

33、應(yīng)條件為： 在pH 7.0的PBS底液中, 1.0 mmol/L H2O2, 在37 (試劑盒標(biāo)示反應(yīng)溫度)下溫育30 min, 電解電位為-300 mV。The love of money is the root of all evil.  3.5 Fe3O4磁性粒子尺寸與磁性對(duì)金膠及抗體的吸附影響考察了粒徑為50, 100, 200, 300和400 nm的Fe3O4微粒在相同條件下吸附納米Au的情況。TEM研究發(fā)現(xiàn), F

34、e3O4微粒粒徑越大, 負(fù)載的納米Au越多, 且吸附的抗體也越多;但是如果金磁微粒粒徑過大, 電極表面Chit膜固定后, 循環(huán)伏安掃描50100次后容易脫附, 造成電流響應(yīng)急劇下降。比較發(fā)現(xiàn)Fe3O4微粒粒徑為200 nm時(shí)合成的金磁微粒在電極表面掃描后不容易脫附, 且可負(fù)載1020個(gè)直徑約為30 nm納米Au。Crumbliss等18研究發(fā)現(xiàn), 小尺寸的金膠(30 nm)能給予蛋白質(zhì)更多的取向自由度, 從而增加輔基靠近金膠的機(jī)會(huì), 使電子方便地通過金膠的傳輸通道。而本實(shí)驗(yàn)合

35、成的單分散nano Au/Fe3O4上金膠直徑約為30 nm, 故具有較好的抗體包被和電子傳輸能力。由于Fe3O4具有超順磁作用, 彼此容易發(fā)生團(tuán)聚而使得電極上的納米界面喪失, 且隨著尺寸變小團(tuán)聚速度加快17, 本實(shí)驗(yàn)中, 50100 nm金磁微粒在Chit膜中30 min內(nèi)會(huì)發(fā)生團(tuán)聚, 引起電流響應(yīng)變小;而對(duì)于粒徑>200 nm的金磁微粒,團(tuán)聚效果較小, 在Chit中分散7 d后也很少團(tuán)聚, 且制備的傳感器電流大小不變。因此選用200 n

36、m粒徑的單分散Fe3O4微粒負(fù)載納米金并包被抗體。3.6 多種免疫傳感器對(duì)HIVgp160的安培測(cè)定比較在優(yōu)化條件下, 傳感器溫育后安培響應(yīng)的降低百分率與gp160濃度呈良好的線性關(guān)系, 線性范圍為1400 g/L, r=0.9960, 檢出限為0.5 g/L(3), 與化學(xué)發(fā)光ELISA法相當(dāng)(0.2 g/L, 0.5350 g/L)3, 明顯優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附比色法(2 g/L, 5150 g/L)2。但是本法較上述方法簡便快速、價(jià)廉。分別比較

37、了本電極(GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160)和抗體包被的納米金修飾電極(GCE|CuL/nano Au/Chit/anti gp160), 以及抗體包被chit膜電極(GCE|CuL/Chit/anti gp160)對(duì)不同濃度gp160的檢測(cè)效果。結(jié)果表明, 在相同制備條件下, 本電極對(duì)gp160檢測(cè)靈敏度(2.5 A·L/g·cm2)最高, 金納米修飾電極和chit膜電極分別為0.7和0.2 A·L/g·

38、;cm2), 測(cè)定范圍也較后二者(1250 g/L和2100 g/L)寬近12倍。這是因?yàn)槊總€(gè)金磁微粒上有多個(gè)納米金, 其在電極表面形成單分子層時(shí)比納米Au有更多的gp160抗體固定點(diǎn), 所以本研究傳感器靈敏度更高, 檢測(cè)范圍更寬。Deeds are fruits; words are but leaves.  將本電極在4 儲(chǔ)存于pH 7.0的PBS 溶液中45 d 后, 其對(duì)50 g/L gp160安培響應(yīng)降低6.5%, 說明該傳感

39、器具有較好的穩(wěn)定性。3.7 干擾實(shí)驗(yàn)、耐用性和電極表面再生  以50 g/L gp160為比對(duì)標(biāo)準(zhǔn), 依次加入8.8 mmol/L 葡萄糖, 0.24 mmol/L 尿酸, 0.5 mmol/L 抗壞血酸(人血清中主要組分的正常濃度水平), 研究表明響應(yīng)電流變化很小(<10%), 證明該傳感器具有良好的抗干擾性。采用同一電極測(cè)定50 g/L gp160 30次后電流下降值<7%。繼續(xù)測(cè)定會(huì)使少量血清蛋白吸

40、附在電極表面, 導(dǎo)致電流減小, 但隨后將電極在含有0.1 mol/L的鹽酸胍PBS底液中浸泡12 h, 抗原從抗體上脫附, 其電流即可恢復(fù)到未使用前狀態(tài)。因此可用鹽酸胍PBS浸泡使電極表面再生。3.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)One ploughs, another sow; who will reap  在正常人血清中加入了610 g/L gp160標(biāo)準(zhǔn)品, 取1 mL樣本溶解在5 mL電解質(zhì)中, 采用本方法進(jìn)行測(cè)定，并與標(biāo)準(zhǔn)EILSA法對(duì)比, 結(jié)果見表1

41、, 吻合性較好。本方法的加標(biāo)回收率為95%102%, 表明本傳感器適用于血清中HIV gp160含量的測(cè)定。表1 血清樣品中HIV gp160檢測(cè)結(jié)果(n=7)The emperor treats talent as tools, using their strongpoint to his advantage.  【參考文獻(xiàn)】  (%)18.128.322.18101.536.216.341.66.595.527.277.421.57.596.9References1 Sandra K

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