登革熱檢測(cè)規(guī)程

1、登革熱（一）登革病毒感染與機(jī)體免疫反應(yīng)？?登革病毒感染后，潛伏期為314天，通常47天，潛伏期內(nèi)采集的患者標(biāo)本 尚不能檢出登革病毒或相應(yīng)的機(jī)體免疫反應(yīng)。發(fā)病后，病毒在血液中存在的時(shí)間（病 毒血癥期）約為7天，病毒NS1抗原在血液存在的時(shí)間略長(zhǎng)。發(fā)病后 45天內(nèi)，可 在病人的血清、血漿、白細(xì)胞、腦脊液和尸檢組織標(biāo)本中分離到病毒，病毒核酸及 NS1抗原在這個(gè)時(shí)期的檢出率高。病人血液中抗體水平，因個(gè)體免疫狀態(tài)不同而具有 顯著差異。若以前沒(méi)有感染過(guò)登革病毒或其他黃病毒，或接種過(guò)黃病毒疫苗（如：乙 腦、黃熱等），病人首次感染抗體免疫反應(yīng)呈現(xiàn)為特異性抗體水平緩慢升高，IgM抗體出現(xiàn)最早，隨后出現(xiàn)的是IgA

2、和IgG抗體。在發(fā)病后35天的患者中IgM抗體檢出 率約為50%,發(fā)病后第5天的患者中檢出率約為80%，而在發(fā)病后第10天患者中，約 99%的患者可檢出。IgM抗體水平在發(fā)病后2周達(dá)高峰，然后逐步下降，可保持 23 個(gè)月。IgA抗體出現(xiàn)略晚于IgM抗體，可保持約45天。在發(fā)病一周后，可在血液標(biāo)本 中檢出較低滴度的IgG抗體，之后抗體滴度緩慢升高，可持續(xù)存在多月甚至終生。如 果病人屬于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染過(guò)登革病毒，有時(shí)可能是 曾接種其他黃病毒疫苗或感染過(guò)其他黃病毒），抗體滴度可快速升高并可和多種黃病 毒產(chǎn)生反應(yīng)。主要為高水平的IgG抗體，在急性期即可檢出，可持續(xù)存在10個(gè)

3、月以上,甚至終生。IgA抗體也可在急性期標(biāo)本中檢出。再次感染登革病毒的病人恢復(fù)期早期的 IgM抗體滴度明顯低于首次感染，甚至無(wú)法檢出，通過(guò)計(jì)算IgM/IgG抗體比例，可以區(qū)分首次或再次登革病毒感染。IgA抗體檢測(cè)試劑在臨床診斷中的應(yīng)用尚處于評(píng)價(jià)階 段。？登革病毒IgM/IgG抗體檢測(cè)規(guī)程【方法】膠體金法【預(yù)期用途】登革熱（Dengue Fever）是一種由登革病毒引起的急性傳染病，主要流行于熱帶和亞熱帶國(guó)家和地 區(qū)。登革病毒為單股正鏈 RNA病毒，在分類(lèi)學(xué)上屬于黃病毒科，黃病毒屬（ flavivirus ）。病毒核心 為RNA與蛋白質(zhì)組成的20面立體對(duì)稱(chēng)的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組成的包膜，

4、包膜含有型和 群特異性抗原。病毒基因編碼 3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白 C，膜蛋白M，包膜蛋白 巳和7個(gè)非結(jié) 構(gòu)蛋白（NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS）。登革病毒感染可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生病 毒特異性的抗體。初次感染者，發(fā)病后3 - 5天可在血液中檢出病毒 IgM抗體，發(fā)病2周后達(dá)到高 峰，可維持2-3個(gè)月，發(fā)病1周后可檢出病毒IgG抗體，IgG抗體可維持?jǐn)?shù)年甚至終生。檢測(cè)臨 床登革熱癥狀的病人樣本中登革病毒抗體，有助于登革熱的輔助診斷?！緳z驗(yàn)原理】采用膠體金免疫層析技術(shù)，在玻璃纖維上預(yù)包被膠體金標(biāo)記的登革病毒抗原（Au-Dengue-Ag ）和羊lgG（Au-

5、羊IgG），在硝酸纖維素膜上IgG檢測(cè)線(xiàn)，IgM檢測(cè)線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn)處分別包被鼠抗人IgG單克隆抗體，鼠抗人IgM單克隆抗體和鼠抗羊IgG單克隆抗體。檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，樣本中登革熱病 毒IgG抗體（或IgM抗體）與Au-Dengue-Ag 結(jié)合形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物沿紙條向前 移動(dòng)，經(jīng)過(guò)IgG檢測(cè)線(xiàn)（或IgM檢測(cè)線(xiàn)）時(shí)與預(yù)包被的鼠抗人 IgG單抗（或鼠抗人IgM單抗）形成 “Au-Dengue-Ag Dengue 病毒抗體鼠抗人 IgG 單抗（或鼠抗人 IgM 單抗）固相材料”夾 心物而富集顯色，膠體金標(biāo)記羊IgG則在對(duì)照線(xiàn)與鼠抗羊IgG單克隆抗體結(jié)合富集顯色，陰性標(biāo)本則僅在對(duì)照線(xiàn)處顯色?！驹?/p>

6、劑組成成分】1 ，登革病毒 IgM/IgG 抗體試劑 檢測(cè)線(xiàn)：鼠抗人IgM抗體、鼠抗人IgG抗體 對(duì)照線(xiàn)：鼠抗羊 IgG 抗體 結(jié)合墊：膠體金標(biāo)記登革病毒抗原和膠體金標(biāo)記羊 IgG 2，梓品稀釋液3， 2uL 吸管【樣本要求】1 ， 檢測(cè)樣本為血清或血漿，避免溶血。2，血漿可用肝素、檸檬酸鈉或 EDTA抗凝。3，采集后的標(biāo)本及時(shí)檢測(cè)， 2 8C密封保存7天，長(zhǎng)期保存需冷凍-20C，忌反復(fù)凍融。【檢驗(yàn)方法】 檢測(cè)前先將冷藏的試劑和待測(cè)樣本恢復(fù)至室溫 1 ， 處理好樣本，取出試劑檢測(cè)卡，水平放置并作好標(biāo)記。2, 用移液器吸取樣本 2uL，或以試劑配置吸管吸取樣本至 2uL刻線(xiàn)，滴加在檢測(cè)卡樣本孔（

7、 S1 孔）。3, 在檢測(cè)卡稀釋液孔（S孔）滴加2滴（70-100uL）樣品稀釋液。4，20 分鐘同觀察記錄結(jié)果?！窘Y(jié)果報(bào)告】陽(yáng)性：質(zhì)控線(xiàn)（C）和檢測(cè)線(xiàn)（G）、檢測(cè)線(xiàn)（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgM/IgG 抗體。質(zhì)控線(xiàn)（C）和檢測(cè)線(xiàn)（G）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒 IgG抗體。 質(zhì)控線(xiàn)（C）和檢測(cè)線(xiàn)（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒 IgM抗體。 陰性：僅在質(zhì)控線(xiàn)（C）出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測(cè)區(qū)（ M ）、檢測(cè)區(qū)（G）未出現(xiàn)紫紅色條 帶，表示樣品中 沒(méi)有登革病毒抗體或抗體濃度低于試劑的檢出水平。無(wú)效：質(zhì)控線(xiàn)（C）未出現(xiàn)紫紅色條帶，表示操作不當(dāng)或者

8、試劑失效，應(yīng)重新檢測(cè)?！緢?bào)告方式】檢測(cè)線(xiàn)（G）、檢測(cè)線(xiàn)（M ）都出現(xiàn)紫紅色條帶登革熱病毒 IgM/IgG 抗體測(cè)定： IgM 陽(yáng)性（ +） IgG 陽(yáng)性（ +）【注意事項(xiàng)】1， 檢測(cè)按照傳染病實(shí)驗(yàn)管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定操作，實(shí)驗(yàn)后按傳染性廢物處理。2， 操作應(yīng)嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3， 保持良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。4， 嚴(yán)格控制在 20 分鐘內(nèi)觀察結(jié)果， 20 分鐘后觀察結(jié)果無(wú)效 ?！緜魅拘詮U物處理】1， 所有實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)熟知并遵守本制度；由專(zhuān)職清潔人員負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)廢棄物處 理。 ?實(shí)驗(yàn)室放置裝有垃圾袋的有蓋污物桶，并貼有明顯標(biāo)識(shí)。2， 每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，及時(shí)清理并妥善包裹廢棄物，送出實(shí)驗(yàn)室并作好實(shí)

9、驗(yàn)室廢棄 物處理記錄。3， 不具有傳染性的實(shí)驗(yàn)室廢棄物（如產(chǎn)品包裝材料和廢紙等辦公垃圾），應(yīng)與傳 染性廢棄物區(qū)分開(kāi)來(lái)，作為普通廢棄物單獨(dú)送醫(yī)療廢物集中處理中心統(tǒng)一處理。4， 血袋、裝血液的試管、離心管、吸頭等由科室洗滌人員用有效氯濃度 ?的愛(ài)爾 施消毒液充分浸泡（60120分鐘），進(jìn)行初步消毒處理。5， 進(jìn)行初步消毒處理的血袋、試管和與受血液污染的棉球、紙片、一次性口罩、 帽子等傳染性或可疑傳染性廢棄物一起放入黃色膠袋中，由廢物集中處理中心 無(wú)害化處理中心封閉運(yùn)輸至焚燒中心進(jìn)行無(wú)害化焚燒處理。6， 每天實(shí)驗(yàn)前，在清洗盆中加入半盆有效氯濃度 ?%的愛(ài)爾施消毒液，實(shí)驗(yàn)中將玻 片、離心管、吸管、吸頭

10、等回收物品充分浸泡（ 60120 分鐘），進(jìn)行初步消 毒處理。7， 收集一天的污染物品用流動(dòng)水沖洗，然后進(jìn)行高壓滅菌處理。登革熱 NS1 抗原檢測(cè)規(guī)程【方法】膠體金法【預(yù)期用途】本試劑采用免疫層析技術(shù)，定性檢測(cè)人血清、血漿或者全血中的登革熱NS1抗原。適用于登革病毒感染的早期輔助診斷和篩查。登革熱是由登革病毒（分 4 個(gè)血清型， DENV1 4）引起的，通過(guò)伊蚊傳播的急性傳染病，多見(jiàn) 于熱帶和亞熱帶地區(qū)。臨床類(lèi)型可分為登革熱、登革熱出血熱和登革休克綜合征三種，該病傳播 迅速，主要臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、頭痛、全身肌肉關(guān)節(jié)疼痛、極度乏力、皮疹、淋巴結(jié)腫大、白細(xì) 胞減少。初次感染登革熱病毒患者，一般臨床

11、表現(xiàn)較輕，可表現(xiàn)為無(wú)癥狀隱性感染，或輕型、典 型登革熱；再次感染異型登革病毒時(shí)，病情較為嚴(yán)重，臨床上出現(xiàn)登革出血熱和休克綜合征的概 率增加，病死率高，是一種具有嚴(yán)重危害性的傳染病?！緳z驗(yàn)原理】本試劑方法采用免疫層析法，應(yīng)用雙抗體夾心法定性檢測(cè)登革熱NS1 抗原。登革熱NS1抗原測(cè)試條的硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)（ T）上包被有抗登革熱病毒 NS1蛋白單克隆抗體， 質(zhì)控區(qū)（C）上包被有抗鼠IgG多克隆抗體，當(dāng)樣本中含有登革病毒 NS1抗原且濃度高于最低檢出 限時(shí)，標(biāo)記有膠體金的抗登革病毒 NS1 蛋白單克隆抗體下血清、血漿或全血中的登革病毒 NS1 抗 原結(jié)合形成反應(yīng)復(fù)合物，在層析作用下復(fù)合物沒(méi)著硝酸纖

12、維素膜向前移動(dòng)，與硝酸纖維素膜上檢 測(cè)區(qū)（T）預(yù)先包被的抗登革熱 NS1抗原單克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并最終形成一條肉眼可見(jiàn)的 紅色反應(yīng)線(xiàn)，此時(shí)的結(jié)果為陽(yáng)性。相反，當(dāng)樣本中不含有登革病毒NS1 抗原且濃度低于最低檢出限時(shí)，則檢測(cè)區(qū)（T）無(wú)紅色反應(yīng)線(xiàn)出現(xiàn)，此時(shí)結(jié)果為陰性。無(wú)論樣本中是否有NSI抗原，在質(zhì)控區(qū)（C）都會(huì)形成一條紅色反應(yīng)線(xiàn)?！局饕M成成份】試劑盒由測(cè)試卡和吸管組成。測(cè)試條由硝酸纖維素膜、樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙、 PVC 板等其他支持物組。 硝酸纖維素膜包被有抗登革病毒 NS1 蛋白單克隆抗體和抗鼠 IgG 多克隆抗體，結(jié)合 墊含 有膠體金標(biāo)記的抗登革病毒 NS1 蛋白單克隆抗體?！緲?/p>

13、本要求】1 ， 血清、血槳、全血樣本均可用于測(cè)試。2， 全血樣本采集后盡可能立即使用，如不能立即檢測(cè)可蔣樣本放置于2-8C 冷藏，全血樣本需在 3 天內(nèi)完成檢測(cè)。3， 血清 / 血槳如不能及時(shí)測(cè)試應(yīng)放置于 2-8C 冷藏，可保存兩周，如需長(zhǎng)期保存應(yīng)置 -20C 冷 凍保存，測(cè)試前注意恢復(fù)至室溫。4， 注意高濃度的黃疸樣本、高度溶血樣本、或肉眼可見(jiàn)多絮狀沉積的乳糜血樣本，將對(duì)檢測(cè) 結(jié)果的干擾，因此在使用樣本前注意樣本的外觀?！緳z驗(yàn)方法】檢測(cè)前先將冷藏的試劑和待測(cè)樣本恢復(fù)至室溫1 ， 取出測(cè)試卡平放于臺(tái)上，并做好標(biāo)記2， 有吸管吸取樣本血清 /血槳 /全血樣本，垂直加入 2-3 滴（約 60-80uL ）于加樣孔中，3， 15-20 分鐘觀察顯示結(jié)果， 30 分鐘后顯示結(jié)果無(wú)臨床意義?！窘Y(jié)果報(bào)告】NS1抗原陽(yáng)性：兩條紅色線(xiàn)，即在檢測(cè)區(qū)（ T）及質(zhì)控區(qū)（C）各出現(xiàn)一條紅色線(xiàn)。NS1抗原陽(yáng)性：一條紅色線(xiàn)，即在質(zhì)控區(qū)（ C）出現(xiàn)一條紅色。無(wú)效：即在質(zhì)控區(qū)（C）無(wú)紅色反應(yīng)線(xiàn)出現(xiàn)。此時(shí)建義重測(cè)。【檢驗(yàn)方法局限性】1， 當(dāng)測(cè)試樣本中登革病毒 NS1 抗原低于最低檢出限或在感染的某個(gè)階段不存在將 會(huì)