HPLC_ELSD測定鹽酸氨基葡萄糖含量

1、第 27卷 第 2期 2008年 4月安 徽 中 醫(yī) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào)J OU RNAL OF AN HU I TCM COLL EGEVol. 27 No. 2 Apr. 2008H PL C 2EL SD 測定鹽酸氨基葡萄糖含量 吳 虹 , 顧宏霞 , 王效山(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 , 安徽 合肥 230031摘要 :目的 :采用反相高效液相色譜 2蒸發(fā)光散射檢測法 (H PL C 2EL SD 測定鹽酸氨基葡萄糖 的含量 。 方法 :色譜柱為 C 18(250mm ×4. 6mm ,5m , 流動相采用甲醇 水 (60 40 , 流速為 0. 6 mg/ml ; 用蒸發(fā)光散射檢測器

2、 (EL SD 檢測 。 結(jié)果 :鹽酸氨基葡萄糖檢測含量為 2. 01710. 084g 時(shí)與峰面積呈良好線性關(guān)系 (r =0. 9995 , 平均加樣回收率為 99. 4%(RSD =0. :此方 法簡單 、 準(zhǔn)確 、 無需衍生反應(yīng) , 精密度和重現(xiàn)性良好 , , 可用 于氨基葡萄糖配合物含量測定 。關(guān)鍵詞 :鹽酸氨基葡萄糖 ; 高效液相色譜 ;中圖分類號 :R927. 2 :A-2219(2008 02-0041-03 D 2(D 2 glucosamine H , 白色結(jié)晶性粉 末 , 分子式 C 6H NO 5HCl , 葡萄糖結(jié)構(gòu)中 C 22羥基 被氨基取代 , 鹽酸與氨基成鹽 ,

3、是甲殼素的一種重要 衍生物 。 GA H 性質(zhì)穩(wěn)定 , 廣泛應(yīng)用于化工 、 醫(yī)藥 、 食品等各個行業(yè) , 又可應(yīng)用于化妝品 、 飼料添加劑作者簡介 :吳虹 (1981- , 男 , 碩士研究生工藝路線 , 經(jīng) 10批中試生產(chǎn) , 證明此工藝在保證療效和質(zhì)量的同時(shí) , 兼有可重復(fù)性和易操作性 , 且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控 , 見表 9。表 9 10批中試生產(chǎn)數(shù)據(jù)批號 藥材量 (kg 出 膏 (kg 干膏粉 (kg 檀香油 (ml 檀香油包合物 (kg 顆粒總質(zhì)量 (kg 灌裝量 (粒 成品率 (% 03040119. 310. 164. 9810. 50. 054. 82961096. 1 03040

4、219. 310. 074. 8411. 80. 064. 73962296. 2 03040319. 39. 935. 019. 90. 054. 89962496. 2 03040438. 620. 169. 8520. 10. 109. 731898694. 9 03050177. 239. 7220. 1144. 50. 2219. 993982699. 5 03050277. 240. 2819. 8743. 70. 2219. 883985199. 6 030503289. 5153. 4075. 26168. 70. 8475. 0414590097. 3 05040119. 3

5、10. 295. 0211. 50. 064. 83974197. 4 05040219. 310. 374. 9910. 70. 054. 74966396. 69 討論益氣和胃膠囊藥味多 , 成分復(fù)雜 , 根據(jù)處方中每 味藥的化學(xué)成分及其藥理作用 , 并結(jié)合該藥作為醫(yī) 院制劑所表現(xiàn)的臨床療效 , 對其制備工藝做了系統(tǒng) 研究 , 最終確定其生產(chǎn)工藝為 :檀香首先提取揮發(fā)油 進(jìn)行 2CD 包合 , 藥渣再與黃芪等藥材加水煎煮 , 考 慮與臨床制劑工藝的一致性 , 煎液濃縮采用低醇醇 沉除雜 , 清膏采用真空減壓干燥 。由于該藥的生藥 量大 , 為了減少服用量 , 采用清膏粉干壓制粒直接制 備膠

6、囊 , 提高了制劑質(zhì)量 。經(jīng)多次中試生產(chǎn)證明該 工藝穩(wěn)定性 、 重現(xiàn)性好 , 適合工業(yè)化生產(chǎn) 。(收稿日期 :2007-12-18 1 4在 525nm 處測定 。亦有研究者使用該法對其片劑 進(jìn)行含量測定 , 但均較為繁瑣費(fèi)時(shí) 。高效液相色譜 2蒸發(fā)光散射檢測法 (HPL C 2EL SD 具有準(zhǔn)確 、 簡便 、 專屬性強(qiáng)等特點(diǎn) 3。 該方法還可以用于硫酸氨基葡 萄糖 、 氨基葡萄糖配合物的含量測定 。EL SD 4-6是一種通用型質(zhì)量檢測器 , 檢測不受 外部環(huán)境的干擾 , 它的通用檢測原理克服了常見于 傳統(tǒng) H PL C 檢測方法的不足 , 已越來越多地應(yīng)用于 高效液相色譜 、 超臨界色譜

7、和逆流色譜中 。 EL SD 基于不揮發(fā)的樣品顆粒對光的散射程度與其質(zhì)量成 正比而進(jìn)行檢測 , 而不依賴于被測物的光學(xué)特性及 官能團(tuán) , 理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何組 分的檢測 。 對沒有紫外吸收 、 熒光或電活性的物質(zhì) 以及產(chǎn)生紫外末端弱吸收的物質(zhì)均能產(chǎn)生響應(yīng) 。 EL SD質(zhì) , 例如脂類 、 糖類 、 蛋白質(zhì)物分析 泛 。本研 究采 用 H PL C 2EL SD , 為鹽酸 氨基葡萄糖提供一種準(zhǔn)確 、 靈敏 、 快捷的分析方法 。 1 方法與結(jié)果1. 1 儀器和試劑 Hypersilo 高效液相色譜系儀 ; SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測器 ;L C solution 色譜工 作

8、站 ; HS3120型超聲震蕩儀 (北京大宇科技有限公 司 ;M ET TL ER TOL EDO A G285電子天平 ; 鹽酸 氨基葡萄糖對照品 (中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)公司 ; 甲醇 (H PL C 級 ; 乙腈 (HPL C 級 ; 娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 。1. 2 色譜條件選擇 分析柱為 Hypersilo C 18(250 mm ×4. 6mm , 5m 。流 動 相 采 用 甲 醇 水 (60 40 , 流速為 0. 6mg/ml , 柱溫為 25 ; EL SD 參 數(shù) :蒸發(fā)管溫度為 46 , 氮?dú)鉃檩d氣 , 流速為 3. 0 L/min 。1. 3

9、 溶液制備1. 3. 1 對照品溶液制備 :精密稱取 0. 2521g 鹽酸 氨基葡萄糖對照品 , 用流動相溶解 , 定容到 50ml 容 量瓶中 , 得濃度為 0. 5042mg/ml 的對照品溶液 。 1. 3. 2 樣品溶液制備 :按對照品溶液的配制方法配 制濃度約為 0. 5mg/ml 待測樣品溶液 。1. 4 分析條件選擇 在 100%,90%,80%,70%, 60%和 50%范圍內(nèi)考察不同比例的甲醇水溶液作 為流動相的情況 , 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) :甲醇在流動相中比 例增大可有效改善色譜峰形 , 有利于各組分的基線 分離 , 但甲醇比例增加不利于鹽酸氨基葡萄糖的溶 解 , 分析時(shí)間也顯

10、著延長 。當(dāng)增加流動相中水的比 例時(shí)分析時(shí)間變短 , 但水的比例過大 , 不利于流動相 在漂移管內(nèi)汽化 , 使基線噪聲增大 , 從而導(dǎo)致分析靈 敏度降低 。 綜合考慮分離效果 、 分析時(shí)間等因素 , 選 擇甲醇 2水 (60 40, V /V 系統(tǒng)作流動相 7。在本實(shí) 驗(yàn)色譜條件下 , 分別測定鹽酸氨基葡萄糖樣品和氨 基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 , 得到色譜圖 1和色譜圖 2 。1. 5 檢測器選擇 EL SD 的響應(yīng)取決于被分析物 質(zhì)顆粒的數(shù)量和大小 , 在 EL SD 中載氣的壓力對信 號的影響很大 。 載氣壓力太低會形成大量的微粒從 而導(dǎo)致尖峰信號或噪聲信號 。當(dāng)載氣壓力太高時(shí) , 微粒量會下降導(dǎo)致

11、信號響應(yīng)降低 , 最終選定的壓力 為 310kPa 。 另一個影響信號響應(yīng)的重要參數(shù)為漂 移管溫度 。 溫度降低時(shí) , 容易揮發(fā)不完全 ; 溫度過高 時(shí) , 分析樣品會有部分揮發(fā) , 導(dǎo)致顆粒量下降而使檢 測器響應(yīng)下降 , 最終選定的溫度為 46 。1. 6 方法學(xué)考查1. 6. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 :取上述配制好的對照品溶 液 , 超聲脫氣后過 0. 45m 濾膜 , 分別精密吸取 1, 2,4,6,8ml 上述溶液定容到 10ml 容量瓶中 , 得濃 度約為 0. 05,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40mg/ml 的對照 品溶液 。 分別進(jìn)樣 20l , 記錄峰面積 。以進(jìn)樣量

12、 (g 對數(shù)值為橫坐標(biāo) , 以峰面積的對數(shù)值為縱坐 標(biāo) , 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 其回歸方程為 y =1. 516x + 4. 289, r =0. 9995。 結(jié)果表明鹽酸氨基葡萄糖含量 為 2. 01710. 084g 時(shí)與峰面積呈良好線性關(guān)系 。 1. 6. 2 精密度試驗(yàn) :精密吸取 “ 2. 3” 項(xiàng)下對照品溶 液 , 重復(fù)進(jìn) 6次 , 每次 20l , 測得 RSD 值為 0. 3%,2 4表明精密度良好 。1. 6. 3 重現(xiàn)性試驗(yàn) :取同一樣品 6份 , 按上述色譜 條件測定 , 測得 RSD 值為 0. 6%, 表明重復(fù)性良好 。 1. 6. 4 穩(wěn)定性試驗(yàn) :精密吸取同一樣品溶

13、液 , 分別 于配制后 0,1,2,3,4,5,6h 測定 , 精密吸取 20l 進(jìn) 樣 , 測得 RSD 值為 1. 34%, 結(jié)果表明鹽酸氨基葡萄 糖在 5h 內(nèi)穩(wěn)定 。1. 6. 5 加樣回收率試驗(yàn) :分別量取 “ 2. 3” 項(xiàng)下 0. 4 mg/ml 的鹽酸氨基葡萄糖對照品 6份 , 依次加入不 同量的鹽酸氨基葡萄糖樣品 6份 , 按上述色譜條件 每份平均進(jìn)樣 3次 , 每次進(jìn)樣 20l , 進(jìn)行測定 。結(jié) 果平均回收率為 99. 4%, RSD =0. 9%, 表明本方法 具有良好的回收率 。 見表 1。表 1 樣品加樣回收率原有量 (mg/ml 加入量(mg/ml 測得量(mg/

14、ml 回收率(% 率 (%0. 40 0. 410.0. 80799. 30. 420. 81999. 80. 430. 833100. 70. 440. 83699. 199. 40. 91. 7 樣品測定 量取待測樣品溶液 3份 , 按上述色 譜條件分別進(jìn)樣 20l , 按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含 量。 結(jié)果含量分別為 98. 92%,99. 05%和 100. 14%。 2 討論通過改變乙腈 、 水和甲醇的比例 , 最后確定以甲 醇 2水 (60 40 作流動相 。 鹽酸氨基葡萄糖在水中極 易溶解 , 而不溶于甲醇 。實(shí)驗(yàn)前不斷調(diào)試甲醇和水 的比例 , 最后確定鹽酸氨基葡萄糖在流動相中的溶

15、 解度也很大 , 所以在樣品溶液制備時(shí)用的是流動相 。 H PL C 2EL SD 法準(zhǔn)確度差 、 線性關(guān)系不好的問題在 實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn) , 其原因主要有 3個方面 : 色譜條 件 :在該色譜條件下鹽酸氨基葡萄糖的峰形好 (理論 塔板數(shù)大于 3000 ; 實(shí)驗(yàn)儀器 :本實(shí)驗(yàn)中高效液相 色譜儀 , 蒸發(fā)光散射檢測器 , 色譜柱性能較佳 , 對測 定很有幫助 ; 鹽酸氨基葡萄糖對照品純度高 。 由于該檢測器的檢測原理是對霧化粒子的大小 和數(shù)量產(chǎn)生響應(yīng) , 故其定量計(jì)算方法與紫外檢測器 不同 。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 , 不同進(jìn)樣量的自然對數(shù)值 與峰面積的自然對數(shù)值為一條不過原點(diǎn)的直線 , 因 此在進(jìn)行含

16、量測定時(shí)須隨行兩個濃度的對照品 , 進(jìn) 樣量和峰面積分別取自然對數(shù)后計(jì)算含量 。 H PL C 2EL SD , 具有 簡單 、 快捷 。:M :化學(xué)工業(yè)出版 , 2000: -ShaoY ,Alluri R ,Mummert M ,et al. A stability 2in 2 dicating HPL C method for the determination of glucosamine in pharmaceutical formulations J.J Pharm Biomedical A 2 nal ,2004,35:625-631.3劉波靜 . 反相高效液相色譜測定 D 2氨

17、基葡萄糖鹽酸 鹽及硫酸鹽的含量 J.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志 , 2007, 41(1 : 60-61.4黃永焯 , 王寧生 . HPL C 2EL SD 在天然藥物中的應(yīng)用 J.中藥新藥與臨床藥理 ,2001,12(6 :444-448.5王明娟 , 胡昌勤 , 金少鴻 . 蒸發(fā)光散射檢測器在藥物 分析 及 其 他 方 面 的 應(yīng) 用 J .中 國 藥 事 , 2002, 16(7 : 431-433.6Kuch A ,Nordhans RS. Evaporative light scattering detection solves common HPL C J .Am Lab , 2001, 3

18、3(6 :61.7劉君 . 煙草中水溶性糖的高效液相色譜測定 J.黑 龍江醫(yī)藥學(xué) ,2006,29(3 :64-65.(收稿日期 :2007-10-24Content Determination of G lucosamine H ydrochloride by HPLC 2E LSD W U H on g , GU Hon g 2x i a , W A N G X i ao 2s han(Pharmacy College , A nhui College of Traditional Chinese Medicine , A nhui Hef ei 230038, China Abstract :Objective :To establish an high performance liquid chromatograp h 2evaporative light 2scatter 2 ing detector (HPL C 2EL SD met hod to determine t he content of glucosamine hydrochloride. Met hods :The H PL C 2EL SD was performed o