基因治療的應(yīng)用及研究進(jìn)展

1、基因治療的應(yīng)用及研究進(jìn)展張峰1,2,霍金龍1,2,曾養(yǎng)志1,21.云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650212;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,云南昆明650201摘要基因治療是一種新的治療手段,可用于癌癥、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等的治療。癌癥基因治療是基因治療的主要應(yīng)用領(lǐng)域。過(guò)去幾年里,全球基因治療臨床試驗(yàn)取得了很大的進(jìn)步,也遇到了很多困難。未來(lái)基因治療的主要目標(biāo)是發(fā)展安全和高效的基因?qū)胂到y(tǒng),它們能將外源遺傳物質(zhì)靶向性地導(dǎo)入特異的細(xì)胞。簡(jiǎn)要綜述了基因治療研究和應(yīng)用的進(jìn)展、困難及其發(fā)展前景。關(guān)鍵詞基因治療;體內(nèi)療法;體外療法中圖分類號(hào)Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼AR

2、esearch Advances and Application on the Gene TherapyZHANG Feng1,2,HUO Jin-long1,2,ZENG Yang-zhi1,21.Banna Mini-pig Inbred Lines Key Laboratory of Yunna Province,Kunming650212G2.Faculty of Animal Science,Yunnan Agricultural University,Kunming650201L ChinaAbstractGene therapy is a new therapeutic tool

3、 for the treatment of diverse types of diseases,including cancer,con-genital genetic,infectious,cardiovascular and autoimmune diseases.Cancer gene therapy is the main studied application of gene therapy.In the last few years,significant advances have been made in the clinical trials about gene thera

4、py world-wide.But some problems still need to be solved.In the future,the main objective in gene therapy is the development of safe and high efficient gene delivery systems that can deliver foreign genetic materials into specific cell types.The main studying advances in the area of gene therapy achi

5、eved recent years were reviewed,and the problems in this field that people have to face in the future were put forwards.Key wordsgene therapy L in vivo9ex vivo文章編號(hào):1009-0002(200704-0677-03綜述1基因治療概述基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞,以糾正基因缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而達(dá)到治療疾病的目的。廣義的基因治療是指利用基因藥物的治療,而通常所稱狹義的基因治療是指用完整的基因

6、進(jìn)行基因替代治療,一般用DNA序列。基因治療常用方法有2種,即體內(nèi)療法(in vivo和體外療法(ex vivo,主要的治療途徑是體外基因治療,即在體外用基因轉(zhuǎn)染病人靶細(xì)胞,然后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞輸入病人體內(nèi),最終給予病人的療效物質(zhì)是基因修飾的細(xì)胞,而不是基因藥物1,2。體內(nèi)療法是將外源基因?qū)耸荏w體內(nèi)有關(guān)的器官組織和細(xì)胞內(nèi),以達(dá)到治療的目的。這些基因藥物可以是完整基因,也可以是基因片段(包括DNA或RNA;可以是替代治療,也可以是抑制性治療(包括DNA轉(zhuǎn)錄水平和mRNA翻譯水平?；蛩幬锊坏捎糜谥委熂膊?而且可用于預(yù)防疾病。這類基因藥物療法簡(jiǎn)單易行,發(fā)展迅速,新型基因藥物也不斷產(chǎn)生3?；蛑?/p>

7、療目前主要用于治療那些對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的疾病,包括遺傳病(如血友病、囊性纖維病、家族性高膽固醇血癥等、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、類風(fēng)濕等等4。2基因治療的應(yīng)用研究進(jìn)展2.1pRNA-納米技術(shù)在分子基因治療中的應(yīng)用RNA可以用作從小到大構(gòu)建納米體系的材料5。RNA沒(méi)有結(jié)合蛋白質(zhì)的時(shí)候,具有非常低水平的或者不易檢測(cè)到的免疫原性。因此,利用從小到大的技術(shù)組裝構(gòu)建的RNA納米粒子克服了上述問(wèn)題,這樣構(gòu)建的藥物輸送系統(tǒng)不含蛋白質(zhì)或多肽,只有25nm,能避免免疫反應(yīng),可以在慢性病的治療中長(zhǎng)期給藥,具有重現(xiàn)性;同時(shí),它的大小適中,避免了過(guò)小分子(<20nm滯留期短、過(guò)大粒子(>

8、;100nm難以輸送的缺點(diǎn)。而多樣性使RNA 納米微粒能夠運(yùn)載多價(jià)治療分子以增強(qiáng)治療效果,使用一個(gè)復(fù)合體來(lái)執(zhí)行多個(gè)分子的功能,將有助于避免治療中可能出現(xiàn)的多重不良反應(yīng),借以發(fā)展一種新的特異治療策略。研究證明,二聚體產(chǎn)物可以將治療性RNA藥物特異性地輸送到特定細(xì)胞6,并可利用pRNA三聚體的形成機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)3個(gè)成分的共輸送。以六聚復(fù)合體形式達(dá)到6種成分的共輸送也是有可能的,因?yàn)閜RNA可形成六聚體7。由于六聚體由6個(gè)pRNA組成,因此,有收稿日期2006-11-03基金項(xiàng)目國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2003AA205009 作者簡(jiǎn)介張峰(1982-,男,碩士研究生通訊作者曾養(yǎng)志,(E-m

9、ailbnwxzjjx6個(gè)可以用來(lái)攜帶細(xì)胞識(shí)別分子、治療分子、檢測(cè)分子的位點(diǎn)。六聚體RNA復(fù)合體的第1個(gè)單體,可被修飾來(lái)連接RNA適體(ap-tamer,能結(jié)合特異細(xì)胞表面受體,由此誘發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用。第2個(gè)單體可以連接熒光染料、重金屬、量子點(diǎn)(quantum dots、熒光珠(fluorescent beads或放射性同位素,作為檢測(cè)癌細(xì)胞發(fā)育的不同階段的信號(hào)。六聚體的第3個(gè)單體可以添加降解內(nèi)體(endosome的化學(xué)物,以促進(jìn)小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA在輸送入核內(nèi)后從內(nèi)體的釋放,從而增強(qiáng)治療的效果。第4個(gè)單體可以連接核苷酸衍生物,如2-氟-2-

10、脫氧-CTP、2-氟-2-脫氧-UTP或錳鐵化合物,以穩(wěn)定體外的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,防止RNase的降解8。第5個(gè)單體則連接治療siRNA、核酶、反義RNA或其他藥物。六聚體的第6個(gè)單體可以被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。這一多價(jià)復(fù)合物同樣可能通過(guò)識(shí)別被感染細(xì)胞表面特有的病毒糖蛋白來(lái)治療慢性病毒感染性疾病,如艾滋病和乙型肝炎。而且,目前已闡明RNA通常不誘導(dǎo)可察覺(jué)的免疫反應(yīng),除非它與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此,RNA作為藥物輸送載體的好處是避免了藥物長(zhǎng)期使用可能引起的免疫反應(yīng)問(wèn)題,以及蛋白質(zhì)載體的排斥問(wèn)題。而這樣一個(gè)RNA復(fù)合物僅25nm,因此其在體內(nèi)滯留時(shí)間更長(zhǎng)。而且,該pRNA分子的毒性或其他不良反應(yīng)可通過(guò)與小的

11、DNA聚合物結(jié)合進(jìn)一步減輕。2.2以siRNA為基礎(chǔ)的基因治療雖然siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用不很廣泛,但它正以飛快地速度發(fā)展成為基因治療的一種新方法。如果siRNA通過(guò)尾靜脈高壓注射能有效到達(dá)肝臟,那么它將可以廣泛用于治療各種肝病9。通過(guò)沉默肝中內(nèi)源性凋亡基因的表達(dá),經(jīng)抗凋亡酶Caspase-8或抗Fas細(xì)胞死亡受體的siRNA預(yù)處理的小鼠能有效預(yù)防各種試劑誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭,用同樣的siRNA也能治療已經(jīng)發(fā)生的肝損傷10。siRNA通過(guò)抑制病毒自身或者抑制病毒轉(zhuǎn)錄所必需的輔助因子,還能達(dá)到抗病毒的目的。將乙型肝炎病毒(HBV基因組和siRNA共轉(zhuǎn)染,可以有效降低HBV的復(fù)制水平和蛋白

12、合成11。Wohlbold證明,用siRNA能有效沉默異常BCR-ABL融合基因的表達(dá),而不影響正常c-BCR和c-ABL的轉(zhuǎn)錄,這為治療Ph染色體陽(yáng)性的慢性粒細(xì)胞白血病提供了新方法12。在血漿中,siRNA雙鏈能抵抗核酸內(nèi)切酶的降解作用,但這并不意味著其能夠穩(wěn)定地存在于機(jī)體內(nèi)13,因?yàn)槲幢恍揎椀膕iRNA不能迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),或者與血漿蛋白親和力低而較早地被機(jī)體清除。如果不是通過(guò)表達(dá)siRNA載體的方法,那么必須經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的siRNA才能更有效地作為基因治療的手段14。有研究正通過(guò)硫磷酰修飾siRNA提高細(xì)胞的攝取能力,從而增強(qiáng)基因沉默的效果15。2005年美國(guó)食品藥品管理局(FDA已批準(zhǔn)經(jīng)

13、過(guò)修飾的siRNA進(jìn)行臨床新藥試驗(yàn),用于治療與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變(age-related macular degeneration的患者。最近, Soutschek經(jīng)鼠尾靜脈注射膽固醇修飾的抗apoB siRNA,能有效沉默同源性靶基因的過(guò)度表達(dá),并且證實(shí)經(jīng)修飾的抗apoB siR-NA導(dǎo)致小鼠膽固醇水平降低的程度與apoB基因敲除小鼠的水平相近,這實(shí)現(xiàn)了siRNA作為靜脈注射性治療藥物的可能。2.3干細(xì)胞應(yīng)用于基因治療的研究進(jìn)展1994年Snoopaa等16報(bào)道,胚胎心肌細(xì)胞植入正常心臟后可長(zhǎng)期存活。給植入的細(xì)胞轉(zhuǎn)染了融合基因-肌球蛋白重鏈基因啟動(dòng)子和-半乳糖苷酶報(bào)告基因,心肌細(xì)胞可表

14、達(dá)許多對(duì)心肌有益的產(chǎn)物,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF等,使植入的心肌細(xì)胞更有利于壞死心肌的修復(fù);2個(gè)月后發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞仍然存活且和受體心肌細(xì)胞形成閏盤結(jié)構(gòu)。從此,干細(xì)胞的基因治療被應(yīng)用于心肌梗死的動(dòng)物模型中。Matsumoto等17用腺病毒作載體,把人的VEGF165轉(zhuǎn)染于Lewis鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC中,然后連同MSC注入同源的心肌梗死1h以后鼠的模型中,并設(shè)對(duì)照組,1周后在心梗區(qū)域可以找到MSC,同時(shí)檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組的VEGF高表達(dá);28d后,無(wú)論是心梗的范圍、左室的容積、射血分?jǐn)?shù)、E/A和心梗區(qū)域毛細(xì)血管的密度,實(shí)驗(yàn)組都明顯優(yōu)于對(duì)照組。

15、同時(shí),通過(guò)免疫組化分析,在實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞和肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了干細(xì)胞移植聯(lián)合基因治療是治療急性心肌梗死的有效方法。Song等18研究發(fā)現(xiàn),MSC對(duì)損傷的心肌有潛在的修復(fù)作用,但是移植的MSC的存活能力低下。為了減少細(xì)胞的損失,用FGF 轉(zhuǎn)染MSC作為移植細(xì)胞,在體外培養(yǎng)。2周后95%以上的細(xì)胞表達(dá)CD75,28%的細(xì)胞表達(dá)心肌特殊轉(zhuǎn)入因子Nkx2.5和-骨骼肌肌球蛋白GATA4。然后把FGF-2基因轉(zhuǎn)染MSC,發(fā)現(xiàn)FGF的分泌增加,Bcl2抗凋亡基因增加,同時(shí)MSC的成活數(shù)量增加3倍。在心梗的區(qū)域注射5×109的轉(zhuǎn)染FGF的MSC,可以存活4周,而且象心肌一樣表達(dá)肌鈣

16、蛋白,產(chǎn)生有功能的腎上腺素受體,梗死區(qū)域的新生血管也增加。由于轉(zhuǎn)染FGF的MSC的存活率明顯上升,新生血管增加,所以得出FGF轉(zhuǎn)染MSC有利于心肌梗死和終末期心衰的結(jié)論。3基因治療的一些問(wèn)題3.1理想載體的選擇一個(gè)理想載體需要有高效的轉(zhuǎn)移率,能將外源基因定向?qū)氚屑?xì)胞,能轉(zhuǎn)導(dǎo)不分裂的細(xì)胞,能穩(wěn)定整合到宿主染色體上。反轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒(AVV可以整合到宿主基因組,其轉(zhuǎn)導(dǎo)率幾乎可達(dá)100%,并可獲得持續(xù)的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移研究中的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)有許多優(yōu)點(diǎn),是目前基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中最常用的,也是成功率最高的。但是反轉(zhuǎn)錄病毒與其他病毒相比又是不穩(wěn)定的,純化和濃縮后的反轉(zhuǎn)錄病毒會(huì)明顯喪失感染

17、能力,這都限制了反轉(zhuǎn)錄病毒在活體內(nèi)應(yīng)用的進(jìn)一步開(kāi)展。至于腺病毒,在離體情況下可獲得高表達(dá),也能維持一段時(shí)間,但它的作用機(jī)制還不是很清楚,而且它在體內(nèi)的復(fù)制將引發(fā)對(duì)安全性的考慮。另外,它的重復(fù)感染所引起的免疫反應(yīng)也是必須考慮的問(wèn)題。不過(guò),腺病毒可以整合到不分裂的細(xì)胞中去,而這正是反轉(zhuǎn)錄病毒所不能做到的。腺相關(guān)病毒的整合效率不及反轉(zhuǎn)錄病毒,但最近的研究表明,它可直接注射于患者體內(nèi),攜帶基因產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物治療疾病。有人把攜帶有因子基因的腺相關(guān)病毒注射到一個(gè)患有B型血友病的病人肌肉中,產(chǎn)生了較好的效果,對(duì)它的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行中。單純皰疹病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中特別有用,但其復(fù)雜的復(fù)制特性和很難獲得重組

18、病毒的原液,均限制了其應(yīng)用前景。由此看來(lái),利用病毒并結(jié)合物理方法是構(gòu)建理想載體的方向。3.2細(xì)胞的選擇由于病毒載體的各個(gè)特定序列往往與特異的細(xì)胞因子結(jié)合,因而靶細(xì)胞類型直接決定載體的表達(dá)效率及存在狀態(tài)。不過(guò),該過(guò)程的詳細(xì)機(jī)制至今仍未闡明。骨髓細(xì)胞是最被重視和最常用的靶細(xì)胞,這是由于骨髓移植(BMT有如下優(yōu)點(diǎn):骨髓組織易于接受各種處理;多年來(lái)應(yīng)用身體或異體BMT治療血液病和惡性腫瘤已累積了豐富的經(jīng)驗(yàn);許多已知的遺傳病都或多或少涉及到源自骨髓的細(xì)胞;源自骨髓的細(xì)胞(如血細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞等遍布全身,幾乎存在于所有的器官和組織中,因而有可能應(yīng)用經(jīng)基因工程改造過(guò)的骨髓細(xì)胞來(lái)治療一些并不直接與骨髓細(xì)胞有

19、關(guān)的遺傳病。但骨髓細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞,也有一些缺點(diǎn):必須用基因工程改造骨髓干細(xì)胞,才能得到穩(wěn)定的持久的治療效果,但干細(xì)胞含量很少,僅占骨髓細(xì)胞的0.1%左右;治療基因在用核骨髓細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)間太短,不超過(guò)幾個(gè)月,對(duì)于人的基因治療來(lái)說(shuō)實(shí)在太短了;只有部分干細(xì)胞具有活性,因而治療基因是否有效取決于是否大部分活性干細(xì)胞含有該基因;骨髓造血干細(xì)胞的分化可能導(dǎo)致基因的失活;有的遺傳性疾病與骨髓細(xì)胞完全無(wú)關(guān)。3.3目的基因的高效表達(dá)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種基因表達(dá)載體及有效的基因轉(zhuǎn)移途徑,但高效的表達(dá)問(wèn)題一直困擾著大家?；虻母咝П磉_(dá)是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題,它受DNA拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄有效性、mR

20、NA的加工轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定性、翻譯有效性,以及蛋白質(zhì)加工、分泌及穩(wěn)定性等因素的影響,而且不同基因高效表達(dá)的限速因素又不一致。因此,提高目的基因表達(dá)的手段不僅限于表達(dá)載體調(diào)節(jié)成分的設(shè)計(jì),人工改造基因使之協(xié)調(diào)于調(diào)節(jié)順序及宿主細(xì)胞也是一個(gè)重要的趨勢(shì)。4基因治療的應(yīng)用前景高效表達(dá)載體和適用于臨床的基因轉(zhuǎn)移方法是決定基因治療成功的基礎(chǔ),在體內(nèi)精密調(diào)控目的基因的表達(dá)是決定基因治療成功的關(guān)鍵,基因治療的安全性是決定基因治療成功的保證?；蛑委煹陌l(fā)展已取得了巨大成就,它已被看成是對(duì)先天和后天基因疾病的潛在的、有效的治療方法,不過(guò)它依然存在缺少高效的傳遞系統(tǒng)、缺少持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)及宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)等問(wèn)題。今后基因治療研

21、究將向2個(gè)方向發(fā)展:其一是基礎(chǔ)研究更加深入,以解決在臨床應(yīng)用中遇到的一些困難及基因治療本身需要解決的一些難點(diǎn)(如靶向性差、可控性弱、目的基因少等為主要研究?jī)?nèi)容;其二是臨床項(xiàng)目增多,實(shí)施方案更加優(yōu)化,判斷標(biāo)準(zhǔn)更加客觀,評(píng)價(jià)效果更加精確。成功的基因治療應(yīng)以安全、有效、簡(jiǎn)便、實(shí)用為目的。隨著人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施和完成,以及新的人類疾病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆,基因治療研究和應(yīng)用將不斷取得突破性進(jìn)展。從理論上看,基因治療的著眼點(diǎn)必須從整體的系統(tǒng)觀點(diǎn)出發(fā),始終著眼于局部與整體、整體與外部環(huán)境的相互聯(lián)系、相互作用、相互制約的關(guān)系19?；蛑委熥罱K要落腳于人類疾病的治療,但基因治療是一種新技術(shù),在理論和技術(shù)方面

22、尚有一些關(guān)鍵問(wèn)題急須發(fā)現(xiàn)和解決。有人提出,為了最大限度地保護(hù)病人,基因治療應(yīng)采用“優(yōu)后原則”,即當(dāng)其他傳統(tǒng)療法無(wú)效或微效時(shí),再使用基因治療,安全性是基因治療首要解決的問(wèn)題。開(kāi)發(fā)一種能高效轉(zhuǎn)移基因、表達(dá)高度組織特異性、能進(jìn)行精確控制表達(dá)的理想載體是關(guān)鍵的突破口。目前病毒載體由于插入后不穩(wěn)定因素太多,雖然表達(dá)較穩(wěn)定,但終究要逐漸被方興未艾的非病毒載體所取代。雖然對(duì)各種新載體的研究尚不健全,且大部分是體外研究,而體內(nèi)外環(huán)境差別很大,但科學(xué)從不會(huì)放棄任何有希望而又有可能的嘗試,要開(kāi)發(fā)出更安全、有效的非病毒載體,還需要漫長(zhǎng)的理論創(chuàng)新和技術(shù)突破,這并不妨礙人們對(duì)它們成為理想的基因治療載體寄予厚望。參考文獻(xiàn)

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