聯(lián)合作用特征評(píng)價(jià)

1、         05-12-16 09:02:00     作者：佚名    編輯：studa9ngns摘要：多年來(lái)，毒藥理界對(duì)機(jī)體內(nèi)多種外來(lái)化合物產(chǎn)生的聯(lián)合作用缺乏統(tǒng)一評(píng)價(jià)體系。本文就其已有的理論基礎(chǔ)和相關(guān)的方法學(xué)成就作一概述，旨在介紹各自的使用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，提請(qǐng)應(yīng)用者根據(jù)條件選用合適的評(píng)價(jià)方法。 關(guān)鍵詞：聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法 工農(nóng)業(yè)迅猛發(fā)展，使得地球上化學(xué)物數(shù)量不斷增加，人類在生產(chǎn)條件或生活環(huán)境中同時(shí)接觸或相繼暴露兩種及兩種以上化學(xué)物

2、已是相當(dāng)普遍1。為了能取得較好的治療效果，多藥聯(lián)用或序貫用藥又是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的主導(dǎo)趨勢(shì)2。多種外來(lái)化合物共存，勢(shì)必對(duì)接觸的生物體產(chǎn)生聯(lián)合作用(jointaction，combinedaction)，亦稱交互作用(interaction)。盡管在藥理學(xué)和毒理學(xué)中聯(lián)合作用分別發(fā)生在不同的劑量水平，對(duì)聯(lián)合作用特征的正確評(píng)價(jià)仍是兩門學(xué)科工作者的當(dāng)務(wù)之急。 在不同的時(shí)期和不同的學(xué)科領(lǐng)域，如生物學(xué)、藥理學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)，聯(lián)合作用具有不同的含義，特征術(shù)語(yǔ)亟待統(tǒng)一和規(guī)范化，對(duì)其評(píng)價(jià)方法也不盡相同3。Bliss在1939年最早提出獨(dú)立、相似和協(xié)同三種聯(lián)合作用模型4。1975年Anderson和Weber把Blis

3、s建立模型應(yīng)用于水生毒物聯(lián)合作用研究5，并引入了濃度相加和反應(yīng)相加的概念。1981年WHO把聯(lián)合作用明確分為四類6：相加、協(xié)同、拮抗和獨(dú)立作用，這種分類方法已為多數(shù)學(xué)者所接受。1988年Rothman等又提出四種不同的聯(lián)合作用類型7：統(tǒng)計(jì)學(xué)、生物學(xué)、公共衛(wèi)生學(xué)和個(gè)體判別的聯(lián)合作用，不過(guò)沒(méi)有被普遍應(yīng)用。 對(duì)同一組資料應(yīng)用不同的分析方法會(huì)得出不同的結(jié)論2。因而就某組特定的混合物而言，很可能用一種方法計(jì)算的結(jié)論是相互協(xié)同，但用另一種方法計(jì)算的結(jié)果卻是相互拮抗。關(guān)于聯(lián)合作用特征的評(píng)價(jià)，國(guó)內(nèi)外尚未形成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)體系8，9。 1等效應(yīng)線圖法 1870年Fraser倡導(dǎo)，1926年Loewe加以發(fā)展的等效應(yīng)

4、線圖法10，是先用加權(quán)直線回歸法求出單獨(dú)與混合后的LD50，再求其毒性比例TR值，以TR界值來(lái)反映結(jié)果性質(zhì)。在試驗(yàn)條件和接觸途徑相同的情況下，分別求出兩個(gè)化學(xué)物的LD50及其95可信限，用縱、橫坐標(biāo)分別代表兩種化學(xué)物的劑量并將取得的同一效應(yīng)的劑量(LD50)點(diǎn)相連即為等效線，然后再將兩化學(xué)物的95可信限的上、下限值分別連接。依據(jù)混合物實(shí)測(cè)LD50在兩種化學(xué)物可信限上、下連線之間位置判定聯(lián)合作用的特征。該法簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，適用于粗略觀察。但是只能評(píng)價(jià)兩個(gè)化學(xué)物的聯(lián)合作用，與其嚴(yán)密的設(shè)計(jì)相比信息利用度不夠，也不適用于非概率型效應(yīng)指標(biāo)資料。 Checkerboard titration法就是基于等效

5、應(yīng)線圖法思想的一個(gè)延伸11，可以從代數(shù)和幾何兩個(gè)角度加以判斷，Berenbaum同時(shí)又將此法推廣到求任意數(shù)量藥物的聯(lián)合作用。等效應(yīng)劑量分析會(huì)受許多因素的影響，且方法本身往往因?yàn)榧夹g(shù)上的差錯(cuò)產(chǎn)生一些差異值，可比性比較差，重復(fù)步驟太多。 Finney根據(jù)Loewe法的劑量比例原則，提出了以各成分LD50為基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)相似聯(lián)合作用的調(diào)和平均數(shù)模型，來(lái)確定混合物的預(yù)期LD50。由于簡(jiǎn)便易行，經(jīng)多數(shù)學(xué)者證實(shí)能較好地預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性。它是在先求出各化學(xué)物的各自LD50值，以各化學(xué)物的聯(lián)合作用是相加作用的假設(shè)出發(fā)，按等毒效應(yīng)劑量預(yù)測(cè)混合化學(xué)物的LD50。用與計(jì)算預(yù)期PLD50時(shí)相同配比的混合物作動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，求

6、出實(shí)測(cè)半數(shù)致死量OLD50和混合物的PLD50與OLD50的比值，即聯(lián)合作用系數(shù)Q，實(shí)測(cè)值小于預(yù)測(cè)值為協(xié)同作用，反之為拮抗作用。 Keplinger等用有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯等15種農(nóng)藥12，按等毒性配比得100多種混合物，分別求得PLD50OLD50，據(jù)此提出了0.571.75之間為相加作用的標(biāo)準(zhǔn)。Smyth將27種化學(xué)物13，同樣按等毒性配比，配成350種混合物，進(jìn)行小鼠聯(lián)合毒性試驗(yàn)，建議按Finney數(shù)學(xué)模型計(jì)算的Q值在0.402.70之間屬相加作用。河合正計(jì)、巖原滋利曾用此法對(duì)8種殺蟲劑和4種殺菌劑配成28個(gè)混合物進(jìn)行測(cè)定14，提出不同的Q值評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 采用Finney的Q值評(píng)價(jià)聯(lián)

7、合作用特征15，因其毒物種類、實(shí)驗(yàn)條件和動(dòng)物種屬的差異，以及 經(jīng)驗(yàn)估計(jì)范圍的不同而使之缺乏可比性。Abt等人提出以O(shè)LD50PLD50作為Q值，其具體分界線用其建議的計(jì)算偏離1的程度公式，然而計(jì)算太繁，應(yīng)用不便。 Finney法又在生態(tài)毒理學(xué)中得到應(yīng)用和擴(kuò)展16，采用等毒性混合法比較預(yù)期EC50和實(shí)測(cè)EC50，由毒性加強(qiáng)指數(shù)TEI來(lái)評(píng)價(jià)其特征。Kissinl等提出的分?jǐn)?shù)(代數(shù))分析法17，基本思路與等效應(yīng)線圖法類同，但允許A、B兩藥以任意比例合用，適用范圍廣，國(guó)內(nèi)仍在采用。1977年Marking提出的相加指數(shù)法是在濃度相加模式基礎(chǔ)上建立的，需要獲得每個(gè)單一毒物的LC50i和在一定比例下幾個(gè)毒

8、物混合的LC50i，以及1981年荷蘭學(xué)者Knemann的聯(lián)合毒性指數(shù)法幾乎是同一思想18。 Moshkovsky曾提出將傳統(tǒng)分類法中的相加作用域定義為完全相加19，而從拮抗域中劃分出部分相加和掩蓋作用區(qū)。導(dǎo)致部分相加作用的原因，一般認(rèn)為是毒物在體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)不一致，以及一些用不同順序染毒或時(shí)間間隔染毒。于鳴按Moshkovsky分類理論發(fā)展了Finney模型20，又提出一個(gè)新的Q值評(píng)價(jià)系統(tǒng)，杜絕了Keplinger，Smyth等標(biāo)準(zhǔn)的主觀性和拮抗作用的假陽(yáng)性。大致過(guò)程包括計(jì)算各組分及混合物L(fēng)D50，并由Finney相加作用理論公式求出預(yù)期LD50，求出Q值及其標(biāo)準(zhǔn)誤和兩倍誤差的可信限范圍。

9、以此可信限與完全相加理論值1，掩蓋作用理論值1Pm作比較，判定聯(lián)合作用。于鳴應(yīng)用Q值系統(tǒng)對(duì)乙醛和丁烯醛的聯(lián)合毒性研究資料進(jìn)行了分析，結(jié)論與采用Finney改良模型的處理結(jié)果相吻合。等效應(yīng)圖解分析法在國(guó)外應(yīng)用較多21，思路和求法與Loewe法類同，只是將它轉(zhuǎn)換成平行線分析，增加了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理22。 2Bliss法 Bliss提出根據(jù)劑量對(duì)數(shù)與死亡概率直線回歸方程23，24，以及化學(xué)物之間聯(lián)合作用模式，確定基本模型表達(dá)式： YmabLog（Q1kQ2KkQ1Q2）Xm Ym：混合物的死亡概率， k：兩種化學(xué)物的毒性比值， Q1，Q2：兩種化學(xué)物的百分比， Xm：混合物的劑量， K：共毒系數(shù)， a，b

10、：方程的截距和斜率。 結(jié)果以相加聯(lián)合作用時(shí)的死亡概率為標(biāo)準(zhǔn)(理論值)與實(shí)測(cè)值比較計(jì)算共毒系數(shù)K，K0表示協(xié)同作用，K0拮抗作用，K0相加作用。該法考慮了混合物毒作用機(jī)制的差別，能較好地對(duì)外來(lái)化合物的聯(lián)合作用進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，然而計(jì)算太復(fù)雜，不便推廣。 3BÜrgi法 合并用藥在臨床上是普遍使用的治療手段，以往均延用BÜrgi氏規(guī)律公式來(lái)判斷合并用藥后的最終效應(yīng)：qEA2B2EA(或EB)，式中EA2B2指A、B兩藥各取半量合用之效應(yīng)，EA、EB分別為A、B單用之效應(yīng)，且EAEB。Savini即用此法求5HT及腎上腺素的合并作用。 然而，金正均指出上述方程中，分子應(yīng)采用原始效應(yīng)之

11、半，分母應(yīng)考慮兩藥聯(lián)合作用時(shí)的新情況，并提出金氏修正式：qE（AB)（EAEBEA·EB)。式中分子代表實(shí)測(cè)合并效應(yīng)，分母是期望合并效應(yīng)，其意義同Brgi式。修正式的優(yōu)點(diǎn)是不必取半量或半效，可以直接利用原始效應(yīng)水平，兩藥效應(yīng)也不必相同。但只適用于定性試驗(yàn)。 周元晏等提出兩個(gè)新公式：qE（AB）EBEA(合并用藥用，要求EAEB)，qECEC(序貫用藥用，EC為A藥的對(duì)照效應(yīng)，EC為在B藥基礎(chǔ)上的A藥效應(yīng))，并認(rèn)為金氏修正式把概率論中衡量?jī)蓚€(gè)獨(dú)立事件概率相加的公式來(lái)衡量合并用藥效應(yīng)期望值，缺乏理論基礎(chǔ)，且沒(méi)有考慮A、B兩藥在合并前后的內(nèi)在活性，混淆了效應(yīng)和概率兩個(gè)不同的概念。 Mans

12、our等報(bào)道了按等毒法評(píng)價(jià)二元混合物的聯(lián)合毒性25。方法是按各化學(xué)物預(yù)期死亡25的劑量混合 染毒，預(yù)期死亡率應(yīng)為50，由實(shí)測(cè)混合物死亡率和預(yù)期死亡率計(jì)算共毒系數(shù)，評(píng)價(jià)混合物的聯(lián)合毒性。Harris等采用按LD50配制二元等毒混合物來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性的方法26。測(cè)定兩種化合物的LD50及其可信限，按混合比例和各自的LD50值推算預(yù)測(cè)LD50及其可信限，預(yù)測(cè)LD50與實(shí)測(cè)LD50之比。同時(shí)根據(jù)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的可信區(qū)間是否相覆蓋進(jìn)行分析，相覆蓋者聯(lián)合作用較弱，反之則強(qiáng)。 4等概率和曲線法 有時(shí)，合并用藥可利用獨(dú)立事件相加概率公式，張效文、金正均提出按效應(yīng)相加的等概率和曲線法。根據(jù)混合物中各化學(xué)物的劑量死

13、亡概率回歸曲線求出預(yù)期死亡概率，再對(duì)概率求和推算死亡率。Q實(shí)際合并效果理論單純相加預(yù)期效果。在實(shí)驗(yàn)室中多采用LD50或ED50作為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)量Q50計(jì)算：Q500.5（PAPBPAPB)。兩個(gè)以上藥物可先從兩個(gè)主藥著手，然后將合并效果作為單一效果，再與其他藥物合并估算。既適合基礎(chǔ)理論研究，又適合聯(lián)合用藥臨床療效和副作用的估計(jì)。等概率和曲線法能給出合并用藥的全貌，省卻運(yùn)算時(shí)間，有一定理論基礎(chǔ)。以等概率和曲線法求得的LD50值一般比等效線圖法求得的TR值要大27，即所判斷的聯(lián)合毒性普遍要大于后者。 5方差分析法 近年來(lái)，許多毒理學(xué)科研人員在研究中采用析因設(shè)計(jì)的方差分析來(lái)判斷外來(lái)化合物聯(lián)合作用特征。

14、將單因素的劑量-效應(yīng)曲線和聯(lián)合作用的劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行重復(fù)設(shè)計(jì)的方差分析，以確定各因素之間有無(wú)交互作用8，29。如2×2析因試驗(yàn)是用于兩個(gè)因素(兩個(gè)藥物或兩種處理方法)30，每個(gè)因素有兩個(gè)水平(用與不用或劑量的不同)的情況。如交互作用不顯著，兩條量效曲線互相平行，則說(shuō)明兩因素之間具有相加作用。如交互作用顯著，兩曲線隨劑量增大而遠(yuǎn)離，兩因素之間具有協(xié)同作用。反之，如兩曲線隨劑量增大而靠近或交叉，兩因素之間具有拮抗作用。該方法是一種比較經(jīng)典的統(tǒng)計(jì)方法31，它可以直接利用連續(xù)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，從而充分利用了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中所含的信息。 6Logistic模型評(píng)價(jià)法 黃炳榮等提出的用Logist

15、ic模型評(píng)價(jià)和確定毒物聯(lián)合作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系32，ED50集合及其置信區(qū)域等，具有客觀和適用范圍廣的特點(diǎn)，為深入研究毒物聯(lián)合作用提供了一種新的方法。其描述毒物聯(lián)合作用的Logistic模型的基本形式為：LnP（1P）01x12x23x1x2，P為反應(yīng)概率。xi為各毒物的劑量，i為模型參數(shù)，3是交互作用參數(shù)。30表示協(xié)同作用，30拮抗作用，30(即3無(wú)顯著性)表示相加作用。i的極大似然估計(jì)值通常是用NewtonRaphson選代法求出，Logistic模型ED50及其漸近置信區(qū)域可用Carter等的方法估計(jì)。根據(jù)Hauck的結(jié)論S50(B)的1保守置信區(qū)域可近似地由下式確定：R2PL（x）1E

16、xp（1B）1PU（x）x*S50（B） 黃炳榮等以硝酸鉛與無(wú)水乙醇為例，在計(jì)算機(jī)上用WLOGIT軟件解出各參數(shù)極大似然估計(jì)值，結(jié)果30，模型的似然比檢驗(yàn)說(shuō)明整個(gè)模型有顯著性。擬合適度檢驗(yàn)P0.50可認(rèn)為模型對(duì)數(shù)據(jù)擬合情況良好。聯(lián)合作用劑量-反應(yīng)關(guān)系和LD50集合及其95置信區(qū)域的結(jié)果最終可在二維、三維空間中擬合。 選用概率效應(yīng)指標(biāo)對(duì)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性，如對(duì)外來(lái)化合物長(zhǎng)期低劑量暴露，或是在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平觀察的聯(lián)合作用進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，就不宜使用LD50或ED50指標(biāo)。改用非概率指標(biāo)以后，化學(xué)物單獨(dú)作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系有可能需用非單調(diào)型曲線描述，同時(shí)效應(yīng)指標(biāo)觀察值也無(wú)1的限制。張俠

17、提出對(duì)聯(lián)合作用劑量反應(yīng)關(guān)系采用廣義三階多項(xiàng)式回歸模型評(píng)價(jià)方法33： R（x，y）R01x2x23x31y2y23y31xy2x2y3xy2交互項(xiàng)之和1xy2x2y3xy2記為I(x，y)。x、y表示兩種受試物各自的劑量，R（x，y)表示效應(yīng)指標(biāo)的觀察值R（x，y)的模擬預(yù)測(cè)值，R0、i、i、i(i1，2，3)是回歸方程的參數(shù)。交互項(xiàng)之和及其置信區(qū)間估計(jì)為：R（x，y）R0（R（x，0）R0R（x，y）R0）I（x，y)  從理論上講，I（x，y)0即兩種化學(xué)物的聯(lián)合作用是簡(jiǎn)單相加。I（x，y)0或0分別表示協(xié)同或拮抗。I（x，y)的符號(hào)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可由I（x，y)的1置信區(qū)間加

18、以判定。以氯化鎘與氯化鎳對(duì)豚鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜的聯(lián)合毒性為例進(jìn)行了演示，判定結(jié)果與采用Logistic模型評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。 研究固定劑量或固定比例設(shè)計(jì)下的聯(lián)合作用資料時(shí)，其單獨(dú)或聯(lián)合的量-效曲線散點(diǎn)圖是三次拋物線型，其資料符合三階多項(xiàng)式模型的重要特征。已有文獻(xiàn)報(bào)道不同效應(yīng)水平(如ED50，ED60等)所對(duì)應(yīng)的聯(lián)合作用特征可能有不一致34，22，而該模型卻能成功地解決這一問(wèn)題。這是三階以下模型所不具備的。使用本法簡(jiǎn)單有效，客觀而適用范圍寬。 7多藥物聯(lián)合作用計(jì)算機(jī)分析法 很多藥物往往不能用較大劑量治療疾病，但為了要達(dá)到較好的治療效果常需合并用藥。徐端正提出多藥物合并指標(biāo)Q（x）及95可信限35，在

19、計(jì)算機(jī)上對(duì)所有反應(yīng)水平(199)進(jìn)行評(píng)價(jià)，多藥物的合并公式： （p1D1xp2D2xpnDnx)DcxQ（x） d1D1xd2D2xdnDnx1 應(yīng)用Bliss法可求出幾個(gè)藥物在合并前后的任何反應(yīng)水平x的等效劑量D1x、D2x、Dnx及Dcx，利用計(jì)算機(jī)可繪出Q（x）曲線，Q（x)的標(biāo)準(zhǔn)誤公式可用函數(shù)方差原理導(dǎo)出。其中Scx2為Dcx的估計(jì)方差，Six2為Dix的估計(jì)方差。利用Q（x）的95可信限公式：Q（x）±1.96SEQ（x），繪出以Q（x）曲線為中心的兩條95可信限曲線，在上、下限曲線范圍內(nèi)包含水平線Q（x）1為相加作用。 Finney在1962年最先提出，Plummer和Short后又加以改進(jìn)的多藥物聯(lián)用的計(jì)算機(jī)分析模型36，區(qū)分相加作用中的協(xié)同還是拮抗，適用于質(zhì)反應(yīng)或量反應(yīng)(經(jīng)概率單位或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換)資料，不須預(yù)先掌握精確的等效劑量信息，對(duì)數(shù)劑量-反應(yīng)曲線不再拘泥于平行關(guān)系，對(duì)單藥或具有相同效應(yīng)的多藥合用同樣適用，具體表達(dá)式為：Y01lgAP·B4（A·P·B)12。Y是反應(yīng)，A、B為兩藥的劑量，P為相對(duì)效率，可由lg（P）23lg（B）求得，BBAP0。如兩藥曲線平行，30，P為常數(shù)。40判為協(xié)同，40拮抗。對(duì)4應(yīng)作是否等于0的顯著性檢驗(yàn)。 8參數(shù)法分析多藥物聯(lián)合作用 鄭青山、孫瑞元根據(jù)靶體動(dòng)力學(xué)原理