過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)二價疫苗治療小鼠幽門螺桿菌感染(一)

1、過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)二價疫苗治療小鼠幽門螺桿菌感染(一)    作者：白楊，陳麗，王繼德，施理，唱韶紅，張兆山，周殿元，張亞歷【關鍵詞】 幽門螺桿菌Immunzition treatment of Helicobacter pylori infection with two valence vaccine composed of catalase and adhesin conservation: An animal model study【Abstract】 AIM: To investigate the effects of two valenc

2、e vaccine consisting of Helicobacter pylori (H. pylori) catalase and adhesin conservation in the treatment of H. pylori infection in an H. pylori infected mouse model. METHODS: C57BL/6 mice infected with H. pylori were divided into seven groups. The mice of each group were immunized respectively by

3、catalase and adhesin conservation (separately, 100 g) plus CT (2 g), catalase (100 g) plus CT (2 g), adhesin conservation (100 g) plus CT (2 g), catalase (100 g), adhesin conservation (100 g) and CT (2 g), PBS orally once a week for four weeks. Four weeks after the last treatment, all animals were s

4、acrificed and stomach biopsies were collected to detect H. pylori by semiquantitative bacterial culture assay. RESULTS: The eradication rate of two valence vaccine group, single valence vaccine group of catalase and single valence vaccine group of adhesin conservation was 69.2%（18/26）, 30.8%（8/26） a

5、nd 38.5%(10/26), respectively. The eradication rate of the other four groups was all 0%. The H. pylori colonized density of the vaccination group was significantly lower than that of the other four groups (P0.05). There were significantly differences in the eradication rate and H. pylori colonized d

6、ensity between the two valence vaccination group and the single valence vaccination groups (P0.05). CONCLUSION: The two valence vaccine consisting of catalase, adhesion conservation and adjuvant has better immunotherapeutic effects than the single valence vaccine. More H. pylori vaccine research sho

7、uld be directed to the multivalence vaccine.【Keywords】 Helicobacter pylori; catalase; adhesin; vaccine【摘要】 目的：利用人類幽門螺桿菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)二價疫苗治療H.pylori感染的作用. 方法：把已感染H.pylori的小白鼠分成7組, 分別通過灌胃方法給予過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)(各100 g)加霍亂毒素CT(2 g)、過氧化氫酶(100 g)加CT (2 g)、黏附素保守區(qū)(100 g)加CT (2 g)，PBS，單純過氧化氫酶(100

8、g)、單純黏附素保守區(qū)(100 g)、單純CT (2 g),1次/wk,共4次,治療結束后4 wk處死動物,取胃黏膜行半定量細菌培養(yǎng)檢查H.pylori情況. 結果：治療實驗各組H.pylori根除率分別為: 過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)加CT組69.2%（18/26）、過氧化氫酶加CT組30.8%（8/26）、黏附素保守區(qū)加CT組38.5%(10/26)；生理鹽水組、單純過氧化氫酶、單純黏附素保守區(qū)、單純CT組根除率均為0%. 未根除H.pylori的小鼠，疫苗治療組H.pylori的定植密度明顯低于其他4組（P0.05）. 此外，二價疫苗組的H.pylori根除率及定植密度較單價疫苗組均有顯著

9、性差異（P0.05）. 結論：由過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)加免疫佐劑組成的二價口服疫苗較單價口服疫苗有更好的免疫治療效果,多價疫苗是未來H.pylori疫苗的研制方向.【關鍵詞】 幽門螺桿菌；過氧化氫酶；黏附素；疫苗0引言1材料和方法1.1材料幽門螺桿菌ss1株為本所保存，無特定病原體（specificpathogen free， SPF）C57BL/6小鼠140只，4 wk齡，雄性，體質量1213 g，飼養(yǎng)條件符合2級動物要求. 重組黏附素保守區(qū)rAB、過氧化氫酶、快速尿素酶試劑由本所制備；其余試劑為國產分析純. H.pylori的固體培養(yǎng)：取冷凍保存的H.pylori菌種一環(huán)于固體培養(yǎng)基上連

10、續(xù)劃線接種，2 h內置厭氧培養(yǎng)箱，37微需氧環(huán)境（50 mL/L O2, 100 mL/L CO2, 850 mL/L N2）中培養(yǎng)72 h，濕度保持95以上. H.pylori的菌落呈園形，凸起、光滑、灰白色、半透明，直徑0.20.8 mm左右. 液體培養(yǎng)：取固體培養(yǎng)基上生長的H.pylori菌落至布氏肉湯中，抽濾瓶抽氣換氣2次以滿足微需氧條件，恒溫振蕩培養(yǎng)120 r/min培養(yǎng)4872 h. H.pylori的鑒定包括菌落形態(tài)、涂片觀察（包括革蘭染色觀察細菌形態(tài)、暗視野觀察細菌活力）、尿素酶實驗（將自制尿素酶試劑加入含鼠胃組織的96孔板各孔中， 37作用5 min，當有H.pylori感染

11、時試劑由黃色變?yōu)榧t色）. 灌胃用H.pylori的要求：革蘭染色陰性，形態(tài)呈S形、螺旋形、桿狀，暗視野下有活力，不含雜菌，密度約為1×1012/L.H.pylori感染小鼠模型的建立:采用文獻4方法馴化H.pylori ss1株，分離可在小鼠胃內穩(wěn)定定植的H.pylori ss1株，固體培養(yǎng)23 d，菌落經(jīng)鑒定后用布氏肉湯洗下，調整細菌濃度至1×1012 CFU/L，每只小鼠灌胃0.5 mL（約1×1012/L）. 所有動物灌胃前禁食12 h，禁水4 h. 灌胃后禁食2 h. 連續(xù)5次，1 wk完成. 采用胃管法以確保H.pylori灌入胃內. 末次灌胃后4 wk

12、隨機處死5只小鼠，剖腹取胃，沿縱軸將胃切為3部分，一份行快速尿素酶試驗，一份置40 g/L甲醛固定供組織學檢查，一份細菌培養(yǎng)，檢查是否感染H.pylori.1.2方法將已鑒定感染H.pylori的小鼠隨機分成7組：二價疫苗組：經(jīng)口喂飼過氧化氫酶和黏附素保守區(qū)各100 加 2 ；單價過氧化氫酶疫苗組：經(jīng)口喂飼過氧化氫酶100 g加 2 ；單價黏附素保守區(qū)疫苗組：經(jīng)口喂飼黏附素保守區(qū)100 g加 2 g；單純過氧化氫酶組：經(jīng)口喂飼過氧化氫酶100 ；單純黏附素保守區(qū)組：經(jīng)口喂飼黏附素保守區(qū)100 /次；單純CT組：經(jīng)口喂飼 2 ；PBS組：經(jīng)口喂飼PBS 200 L/次. 前3組為治療組，每組28

13、只小鼠；后4組為對照組，每組10只小鼠. 免疫治療前小鼠禁食12 h，禁水4 h. 每只小鼠先用30 g/L碳酸氫鈉100 L灌胃以中和胃酸，10 min后分別按上述分組灌胃，30 min后再給小鼠提供水和食物. 隔周免疫，加強免疫3次，劑量同前. 末次免疫后4 wk，禁食1 d，摘眼球放血處死動物，用750 g/L乙醇浸泡小鼠體表5 min以上. 在超凈工作臺內迅速取出胃用于免疫治療后幽門螺桿菌根除的鑒定，方法采用半定量細菌培養(yǎng)法5，胃組織稱質量后，制成勻漿，用布氏肉湯倍比稀釋后，取200 L涂于Hp固體培養(yǎng)基，菌落計數(shù)后，計算單位胃組織的定植細菌密度.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 10.0軟件

14、，計數(shù)資料行2檢驗，計量資料的比較采用方差分析，P0.05為有顯著性差異.2結果經(jīng)尿素酶實驗、組織病理學檢查（Fig 1）及細菌培養(yǎng)證實5只隨機處死的小鼠全部感染H.pylori. 細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)胃組織H.pylori的定植密度為1×1051×106/g.胃組織培養(yǎng)H.pylori為陰性者定為根除，疫苗治療組根除率顯著高于其他4組（P0.05，Tab 1）. 未根除H.pylori的小鼠，我們進行了H.pylori定植密度的分析，結果發(fā)現(xiàn)疫苗治療組H.pylori的定植密度明顯低于其他4組，其差異有顯著性（P0.05）. 而且，二價疫苗組的H.pylori根除率及定植密度較單

15、價疫苗組均有顯著性差異（P0.05）.表1感染H.pylori小鼠免疫治療后的根除率（略）3討論【參考文獻】1 Bai Y, Zhang YL, Jin JF, et al. Recombinant Helicobacter pylori catalaseJ. World J Gastroenterol,2003;9(5):1119-1122.2 白楊,張亞歷,王繼德,等.幽門螺桿菌黏附素基因保守區(qū)的克隆及免疫原性研究J.中華醫(yī)學雜志,2003,83(9):736-739.Bai Y, Zhang YL, Wang JD, et al. Cloning and immunogenicity of conservative region of adhesin gene of Helicobacter pyloriJ.Chin Med J, 2003;83(9):736-739.3 白楊,張亞歷,陳燁,等.幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)蛋白的免疫原性、安全性和粘附作用的體外評價J.生物化學與生物物理進展，2003;30(3):422-426.Bai Y,Zhany YL,Chen Y, et al.Study of Immunogenicity and safety and adherence of conservative region o