廣西菲牛蛭提取物抗動(dòng)物血栓形成的作用

1、廣西菲牛蛭提取物抗動(dòng)物血栓形成的作用水蛭是我國傳統(tǒng)中藥，主要用于治療痞塊、血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷。廣西菲牛蛭唾液腺分泌物亦富含菲牛蛭素、纖溶酶、透明質(zhì)酸酶血管擴(kuò)張劑等多種肽類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換和凝膠過濾等方法從廣西菲牛蛭中分離純化出富含菲牛蛭素、纖溶酶的提取物并利用該提取物研究抗動(dòng)物血栓效應(yīng)，以期開發(fā)新型的抗血栓生物制劑。1材料與方法1.1 藥物：菲牛蛭提取物(100ATU/ml),由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供。1.2 動(dòng)物：家兔，體重1.82.5kg；SD大鼠，體重200300g；動(dòng)物雌雄兼用，均為清潔級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3 試劑和儀器：戊巴比妥鈉、枸檬酸鈉、電子天

2、平、秒表。體外血栓形成儀：按Chandler氏體外血栓形成裝置,蠕動(dòng)泵改裝的泵軸裝一個(gè)有機(jī)玻璃盤，有內(nèi)徑4 mill、長250 mill、半徑38 mm的聚氯乙烯管環(huán),固定盤上,管環(huán)平面與地平夾角為74。，管環(huán)內(nèi)可盛血液，整個(gè)儀器置于自動(dòng)控溫培養(yǎng)箱中。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 家兔體外血栓形成實(shí)驗(yàn)：取家兔32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，各兔靜脈注射1戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉。分離家兔股動(dòng)脈，取血1ml注入聚乙烯管中，各給藥組(L5、0.75、0.5ATU3個(gè)劑量組)在管中注入0.2ml菲牛蛭提取物，對(duì)照組注人相同體積生理鹽水，按Chandler氏法，使血液在37條件下以16/rnin

3、的速度在體外血栓形成儀上旋轉(zhuǎn)10min,制備血栓。用濾紙吸干血栓水分，稱取血栓濕重，濕血栓自然風(fēng)干6h,為干血栓。1.4.2 大鼠血栓形成實(shí)驗(yàn)：以60ATU/kg劑量菲牛蛭提取物股靜脈注射SD大鼠，分別于給藥前、給藥后5、10、15min從腹主動(dòng)脈抽血1ml,按上述Chandler氏改良法制備血栓，觀察水蛭素對(duì)血栓形成的抑制作用。1.4.3 大鼠靜脈血栓形成實(shí)驗(yàn)：采用Reyers法改良制備大鼠靜脈血栓模型，取大鼠10只，隨機(jī)分成2組(水蛭素提取物60ATU/kg組和生理鹽水對(duì)照組)，每組5只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，開腹分離下腔靜脈，于左腎下方用線結(jié)扎，給藥組由靜脈注射

4、水蛭素，對(duì)照組給予等量生理鹽水，20min于結(jié)扎處下方2cm處結(jié)扎血管，阻斷血流，2h后，縱行剖開下腔靜脈取出血栓，稱濕重，風(fēng)干6h稱干重。1.4.4 家兔動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)：采用Teruhiko法制備家兔動(dòng)脈血栓模型，取家兔6只，注射1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，分離左側(cè)的頸總動(dòng)脈和右側(cè)的頸外靜脈，在7cm的聚乙烯管中放一根預(yù)先稱重的4號(hào)手術(shù)線。以3.8的枸檬酸鈉浸潤管壁后插入左頸動(dòng)脈和右頸靜脈之間，術(shù)后開放血流后15min,取出手術(shù)線稱重，減去原線重量即為藥前血栓濕重。然后靜脈注射菲牛蛭提取物，于給藥后15、30、45、60min分別測定聚乙烯管中手術(shù)線重量，減去原線重量，即得藥后不

5、同時(shí)段的血栓濕重，風(fēng)干6h,稱血栓干重。并計(jì)算抑制率抑制率=(對(duì)照組血栓重量給藥組血栓重量)/對(duì)照組血栓重量x100o1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用成組設(shè)計(jì)方差分析處理，各項(xiàng)指標(biāo)均以(x±S)表示。2結(jié)果2.1菲牛蛭提取物對(duì)家兔體外血栓形成的影響：大、中劑量組與對(duì)照組相比，菲牛蛭提取物對(duì)家兔體外血栓形成比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),血栓抑制率為24.3100%o小劑量組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)見表lo表1菲牛蛭提取物對(duì)家兔體外血栓形成的影響(x±s,n=8)組別TAU劑量八里(m/mg)濕重抑制率干重(%)干重抑制率(%)(m

6、/mg)對(duì)照組39.39±5.877.91±1.31大劑量組1.50*±01000*±0100中劑量組0.7525.76±2.67*34.66.01±1.02*24.3小劑量組0.536.55±7.907.27.47±2.295.6注：與對(duì)照組相比，*P<0.01*P<0.052.2菲牛蛭提取物對(duì)大白鼠血栓形成的影響：與對(duì)照組比較，給藥組藥后5min對(duì)大白鼠半體內(nèi)血栓形成影響不大(P>0.05),藥后10、15min對(duì)大白鼠半體內(nèi)血栓形成影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),血栓的濕重明顯減

7、小或完全消失(見表2)o表2菲牛蛭提取物對(duì)大鼠血栓形成的影響(x±s,n=5)組別劑量(ATU/kg)藥后血栓濕重(m/mg)5minlOmin15min對(duì)照組12.69±3.04 12.84 ±3.71 11.92± 2.58給藥組 60 13.45注：與對(duì)照組相*±3.957.68±2.86*0±0*P<0.014P<0.05比，2.3菲牛蛭提取物對(duì)大鼠靜脈血栓形成的影響(見表3)：表3菲牛蛭提取物對(duì)大鼠靜脈血栓形成的影響(x±s,n=5)組別劑量(ATU/kg)血栓濕重(m/mg)血栓干重(m/m

8、g)血栓形成率(%)對(duì)照組7.72±3.72.46±1.26100給藥組600*±00±0*0注：與對(duì)照組相比，*P<0.01z*P<0.05表3可見，大白鼠靜注菲牛蛭提取物60ATU/kg后，大鼠靜脈血栓形成率為0,血栓干濕重為0,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)o2.4菲牛蛭提取物對(duì)家兔動(dòng)脈血栓的溶栓效應(yīng)(見表4、5)o表4菲牛蛭提取物對(duì)家兔動(dòng)脈血栓濕重的影響(X±s,n=6)劑量藥前藥后ATU/kg(m/mg)15min30min45min60min6030.25±6.7920.69±6.

9、74*17.56±4.87*19.88±5.34*26.72±9.64抑制率-30.942.034.311.7注：藥后與藥前相比，><0.05表5菲牛蛭提取物對(duì)家兔動(dòng)脈血栓干重的影響-±s,n=5)劑量藥前藥后(m/mg)ATU/kg(m/mg)15min30min45min60min±1.63607.18±1.574.98±1.554.06±1.02*4.38±0.60*5.88抑制率30,6 43.438,9 18.1注：藥后與藥前相比，*P<0.05由以上結(jié)果表明，60ATU/kg

10、菲牛蛭提取物對(duì)大鼠靜脈血栓形成有完全抑制作用，為高劑量組，而對(duì)于家兔動(dòng)脈血栓形成抑制率在30%40%之間，屬中劑量組。給藥組與對(duì)照組比較，可明顯減輕家兔動(dòng)脈血栓和大鼠靜脈血栓重量，且未見異常反應(yīng)和出血。3討論血栓性疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，探索預(yù)防和治療血栓性疾病的藥物顯得十分重要?？寡“骞δ芤种苿┖涂鼓齽┦强顾ㄖ委煹挠行мk法。肝素和華法林在抗凝治療中已應(yīng)用了數(shù)十年，目前仍是臨床上治療各種血栓栓塞的常用藥物。但由于這兩種藥物仍有許多局限性，據(jù)報(bào)道，3%的病人在使用肝素5d后會(huì)出現(xiàn)由肝素引起的血小板減少癥?？茖W(xué)家正在廣泛尋求新藥，以提高療效和安全性。誘導(dǎo)管內(nèi)血栓形成的因素有很多種，但根

11、本因素是血液凝固、血小板黏和聚集。靜脈血栓形成主要由于血液凝固，動(dòng)脈血栓形成則主要是小板在動(dòng)脈中黏附和聚集。血小板聚集性過高是促使心血管疾病發(fā)展的重要因素。凝血酶在凝血過程中起著至關(guān)重要的作用；使纖維蛋白原變成纖維蛋白，最終使凝塊形成。凝血酶也是引起血小板聚集的最主要激活劑之一。由于凝血酶在血液凝固過程及血小板激活過程中具有雙重作用，近年來對(duì)凝血酶抑制劑的研究特別受到重視。抑制血栓的形成一般有3條途徑：一是促進(jìn)纖溶系統(tǒng)對(duì)纖維蛋白原或纖維蛋白的降解；二是抑制凝血功能；三則是抑制血小板的聚集、黏附、釋放功能。體內(nèi)外試驗(yàn)表明：水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，對(duì)各種血栓性疾病都有效。水蛭素作用機(jī)制是它與凝血酶按1：1比例非共價(jià)結(jié)合形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制了凝血酶的活性，阻止纖維蛋白原及凝血酶對(duì)血小板的作用，達(dá)到抗凝目的。水蛭素在常溫干燥狀態(tài)下比較穩(wěn)定，其作用不依賴于ATIII等血漿輔助因子，其抑制血栓形成的濃度遠(yuǎn)小于其引起出血的濃度，無明顯毒副作用。動(dòng)物性試