昆蟲抗凍蛋白的分離純化及特性分析

1、昆蟲抗凍蛋白的分離純化及特性分析摘要 昆蟲抗凍蛋白具有很高的熱滯活性，可保護(hù)機(jī) 體免受結(jié)冰引起的傷害。昆蟲抗凍蛋白的分離純化多采用凝 膠過(guò)濾層析、離子交換層析及HPLC等技術(shù)，已用于魚類抗凍蛋白純化的冰親和純化（IAP）技術(shù)也可考慮應(yīng)用于昆蟲抗凍 蛋白的分離提純。昆蟲抗凍蛋白具有高活性，規(guī)則的一級(jí)結(jié) 構(gòu)及類似的冰晶結(jié)合表面等特性。關(guān)鍵詞 昆蟲抗凍蛋白，分離純化，特性抗凍蛋白（antifreeze protein ，AFP首先由 Devries 在南極 海峽的一種 Nototheneniid 魚的血液中首次發(fā)現(xiàn)。 目前研究發(fā) 現(xiàn)，很多生物體都能產(chǎn)生抗凍蛋白保護(hù)機(jī)體免受結(jié)冰引起的 傷害，包括多種海

2、洋魚類，陸生節(jié)肢動(dòng)物，植物和細(xì)菌體內(nèi) 發(fā)現(xiàn)多種抗凍蛋白。依據(jù)來(lái)源的不同，可將抗凍蛋白分為魚 類抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白和微生物抗凍蛋 白四大類。魚類抗凍蛋白又分為 6 大類：抗凍糖蛋白 （antifreeze glycoprotein , AFGP, lW型抗凍蛋白（AFP、AFP H、AFP AFPIV ）和高活性抗凍蛋白 Hyperactive AFP。植物 抗凍蛋白研究較深入的主要為胡蘿卜（Daucuscarota）抗凍蛋白（DcAFP和黑麥草（Loliumperenne）抗凍蛋白（LpAFP）o對(duì)微生 物抗凍蛋白的研究則還處于起步階段。 Gfimstone 等人首先 證明黃

3、粉甲 Tenebrio molar 幼蟲能夠產(chǎn)生抗凍蛋白，隨后， 科學(xué)家們?cè)诜謱儆?9 目、 20 科的 50 多種昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗 凍蛋白的存在。目前研究比較透徹的昆蟲抗凍蛋白主要包括 黃粉蟲 AFP(TmAFP、) 云杉卷夜蛾 Choristoneura f umiferana AFP(CfAFF和赤翅甲 Dendroides canadensis AFP(DAFP。根據(jù) 其特性的不同，抗凍蛋白又有多種命名，如冰結(jié)構(gòu)蛋白 (ice structuring proteins , ISP)抗凍蛋白(AFP)及熱滯蛋白(thermal hysteresis proteins， THP)?？箖龅鞍?/p>

4、的主要特征是產(chǎn)生熱滯效應(yīng)和重結(jié)晶抑制效應(yīng)。耐寒生物(freeze avoidance)如大多數(shù)昆蟲和魚類抗凍蛋 白主要通過(guò)熱滯效應(yīng)來(lái)保護(hù)機(jī)體免受凍害，抗凍蛋白降低溶 液冰點(diǎn)的作用效果不受分子數(shù)量的影響，只受蛋白質(zhì)性質(zhì)的 影響，即非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)，同時(shí)不影響融點(diǎn)，從 而產(chǎn)生冰點(diǎn)和融點(diǎn)的差值，這個(gè)值即為熱滯值，它的高低可 以用來(lái)衡量抗凍蛋白抗凍活性的強(qiáng)弱。而對(duì)于可以忍受胞間結(jié)冰的耐凍生物 (freeze tolerance) 如大多數(shù)越冬的植物和少數(shù)昆蟲的抗凍蛋白則主要通過(guò)重 結(jié)晶抑制效應(yīng)來(lái)降低生物有機(jī)體因體內(nèi)結(jié)冰引起的傷害?？?凍蛋白除了可以特異的、不可逆的與冰晶結(jié)合，抑制冰晶生 長(zhǎng)，同

5、時(shí)改變冰晶形態(tài)，還可以降低過(guò)冷點(diǎn)，抑制成冰核蛋 白的作用和降低玻璃化與去玻璃化損傷，以及通過(guò)與細(xì)胞膜的脂雙層結(jié)構(gòu)的結(jié)合，提高細(xì)胞膜的相變溫度改變?；湹?分子包裝，減少細(xì)胞膜的滲透性，阻止離子滲漏，提高生物 有機(jī)體的耐寒性。 AFP 的這些性質(zhì)可被應(yīng)用于改良動(dòng)植物品 種和低溫保存等，有著廣闊的應(yīng)用前景。本文將對(duì)昆蟲抗凍 蛋白的分離純化及其特性作一綜述。1 昆蟲抗凍蛋白的分離純化1.1 昆蟲抗凍蛋白分離純化常用技術(shù) 抗凍蛋白多是從經(jīng)過(guò)低溫馴化或越冬的昆蟲成蟲或幼 蟲體內(nèi)提取和純化的。目前，已分別從黃粉蟲、赤翅甲、云 杉卷葉蛾、松皮天牛 Rhagium inquisitor 、日本松針癭蚊 The

6、codiplosisjaponensis 和雪蚤 Hypogastrura harveyi 中純化出 了天然抗凍蛋白，常用技術(shù)包括離子交換層析、凝膠過(guò)濾層 析、高效液相色譜 HPLC以及快速蛋白液相色譜 FPLC等。Graham 等人采用 Sephadex 凝膠過(guò)濾層析和反相 HPLC 首次從黃粉蟲血淋巴中純化得到ug級(jí)的高活性8.4 kDaTmAFP Lieu等人又進(jìn)一步完善了 TmAFP的提取方法，采用 Sephacry 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行初步分離后，進(jìn)一步采用反相 HPLC半制備型和分析型 C18柱分離純化獲得了一系列具熱 滯活性的同系物。HPLC是目前分離昆蟲 AFP的常用方法，DAFP

7、和CfAFP也均采用該種方法進(jìn)行分離。 但 Kristiansena 等人研究發(fā)現(xiàn)該 法對(duì)松皮天牛幼蟲血淋巴中AFP(RiAFP的分離純化不適用，可能的原因是洗脫過(guò)程引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)像的改變，從而使 大部分蛋白失活。他們采用熱變性和三氯乙酸沉淀的方法對(duì) 血淋巴進(jìn)行預(yù)處理，粗提液經(jīng)陽(yáng)離子交換層析分離，再進(jìn)一 步用凝膠過(guò)濾層析純化得到了至少 6 種分子量在 12.512.8 kD 之間的 RiAFP。Marshall 等人采用 SephadexG75 凝膠過(guò)濾層析對(duì)冬鰈 Pseudopleuronectes americanus 的血漿進(jìn)行初步分離， 收集前 期有熱滯活性的分離物進(jìn)行冰親和純化 (

8、ice affinity purificmion , IAP),再用DEAE纖維素陰離子交換層析分離 得到了 17 kDa 的高活性抗凍蛋白。冰親和純化是利用 AFP 對(duì)冰的吸附作用，生長(zhǎng)的冰晶會(huì)將它選擇性地包裹從而實(shí)現(xiàn) 分離。 Gauthier 等人也采用冰親和純化的方法從黃尾鰈 Limandaferruginea 和美洲歐蝶 HipI,pogIossoides pIatessoides 血液中分離得到2種具高熱滯活性的 AFPO這種分離方法對(duì) AFP有較高的特異性，可以考慮應(yīng)用于昆蟲AFP的純化。1.2 昆蟲抗凍蛋白分離純化的來(lái)源材料目前，昆蟲天然抗凍蛋白的分離純化有2個(gè)主要來(lái)源。從血淋巴

9、中分離是來(lái)源之一也是最主要的途徑。昆蟲抗凍蛋 白主要由脂肪體合成，經(jīng)分泌、運(yùn)輸進(jìn)入血淋巴行使功能， 因此，血淋巴中含有相對(duì)豐富的抗凍蛋白。對(duì)昆蟲抗凍蛋白 的研究最初都是通過(guò)檢測(cè)血淋巴是否存在熱滯活性來(lái)推斷 抗凍蛋白的存在。上述 TmAFP DAFP CfAFP和RiAFP均實(shí) 現(xiàn)了從血淋巴中的分離。 然而，由于蟲體中血淋巴含量較少， 受蟲體大小、不同發(fā)育階段及種類的影響，從血淋巴中分離 抗凍蛋白要求的樣本數(shù)量一般較大。昆蟲蟲體也可以直接作為抗凍蛋白分離的材料。難以采 集血淋巴的微小昆蟲多采用該方法。 Li 等人以日本松針癭蚊 越冬 3 齡幼蟲為材料，采用乙醇沉淀，三氯乙酸處理后經(jīng)陰 離子交換層

10、析(DEAE sephadex A- 25)和凝膠過(guò)濾層析 (sephadex G 100)分離純化得到2種抗凍蛋白，分子量分別 是 34.9 和 37.8 kDa。 Graham 等人也以雪蚤成蟲蟲體為材料 分離純化出 2 種抗凍蛋白。 Wu 等分別采用赤翅甲幼蟲血淋 巴和蟲體作材料純化 AFP,蟲體經(jīng)勻漿，乙醇沉淀、透析及 DEAE SepharoseCL 6B 陰離子交換層析的預(yù)處理后采用與血淋巴中抗凍蛋白分離純化相同的方法，即經(jīng)凝膠過(guò)濾 層析后采用反相高效色譜最終分離得到了與血淋巴中相同 的 4種抗凍蛋白。但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲抗凍蛋白不僅存 在與血淋巴中，在腸液和表皮下的上皮細(xì)胞中也

11、有存在。在 對(duì)不同組織部位 AFP的特定表達(dá)研究中，中腸、后腸腸液以 及上皮細(xì)胞常被選作 AFP的分離材料。Duman等人對(duì)赤翅甲 不同組織部位的抗凍蛋白分析發(fā)現(xiàn)，盡管所有DAFP同系物基因在脂肪體均有轉(zhuǎn)錄，但在不同的組織部位DAFP的類型卻有所差別，在血淋巴中只能分離檢測(cè)到 4種DAFP,其它類 型則出現(xiàn)在中腸腸液和上皮細(xì)胞中。研究結(jié)果不僅暗示不同 的抗凍蛋白在特定組織中起著不同的作用，而且也提示我們 血淋巴中提取的抗凍蛋白不能代表全部的抗凍蛋白，以全蟲 為材料提取的抗凍蛋白種類可能會(huì)更多。但由于昆蟲抗凍蛋白的分子量較小(TmAFP為8.4- 10.8 kDa,CfAFP約為9 kDa, D

12、AFP為 7.4 - 8.7 kDa, SfAFP為 6.5 和 15.7 kDa),而且含量非 常低，從蟲體中分離，需經(jīng)復(fù)雜的預(yù)處理步驟，即在不影響 抗凍蛋白活性的前提下，大量去除比血淋巴中多得多的雜蛋 白，然后再進(jìn)一步純化，這個(gè)過(guò)程中可能會(huì)造成部分含量甚 微的抗凍蛋白損失而無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)。因此，在昆蟲樣本較 多的條件下，多數(shù)會(huì)選擇血淋巴作為抗凍蛋白提取的材料來(lái) 源。目前，多數(shù)昆蟲抗凍蛋白的編碼基因?qū)崿F(xiàn)了克隆，并成 功進(jìn)行了原核或真核表達(dá)。許多原核表達(dá)的重組蛋白與天然 蛋白的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)差別不大，因此在對(duì)抗凍蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和 功能的研究中可以直接采用重組蛋白替代天然蛋白。2 昆蟲抗凍蛋白的特性2

13、.1 超強(qiáng)的抗凍活性 在生理狀態(tài)下，昆蟲抗凍蛋白可以把血淋巴的冰點(diǎn)降低5C甚至更多，而一般魚類抗凍蛋白只能把體液冰點(diǎn)降低1.5 C,昆蟲抗凍蛋白具有比魚類抗凍蛋白更高的熱滯活性。黃粉蟲的8.4 kDa TmAFP在gmol級(jí)濃度時(shí)，其熱滯活性高達(dá)5.5 C,是多數(shù)魚類抗凍蛋白熱滯活性的10- 100倍；云杉卷葉蛾的9 kDaCfAFP- 337其熱滯活性可達(dá)到 10 C；而赤翅甲 抗凍蛋白DAFP- 1熱滯活性也在3- 6C之間；雪蚤的2種抗 凍蛋白SfAFP在umol濃度時(shí)，熱滯活性均大于 2C。重組昆 蟲抗凍蛋白的熱滯活性也比魚類的高。作為例外， Marshall 在極地魚美洲擬鰈 (Pl

14、eurortectesarnericantts) 中發(fā)現(xiàn)的高活性 抗凍蛋白其熱滯活性可與昆蟲AFP相媲美。與一般的魚類AFP相比，昆蟲AFP較高的熱滯活性并不取決于它們與冰晶 結(jié)合的親和力高低，而是與抑制冰晶生長(zhǎng)部位，重復(fù)出現(xiàn)的 規(guī)則平面型的冰結(jié)合表面柏。及特殊的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸重 復(fù)單位所形成的螺圈數(shù)有關(guān)。此外， Duman 在對(duì)北極和阿拉斯加的多種昆蟲研究中發(fā)現(xiàn)，一些能夠在-40- -70 C生存的耐凍昆蟲也產(chǎn)生AFP,這些AFP的重結(jié)晶抑制作用可能比熱滯效應(yīng)更為重要。因?yàn)橹亟Y(jié) 晶抑制作用比冰晶生長(zhǎng)的抑制作用更容易達(dá)到和控制，只需 少量的AFP就能產(chǎn)生較高的重結(jié)晶抑制活性，從而避免冰晶 對(duì)

15、細(xì)胞組織的傷害。2.2 規(guī)則的一級(jí)結(jié)構(gòu)昆蟲抗凍蛋白多為小分子物質(zhì)，具有獨(dú)特的B 螺旋結(jié)構(gòu)，雖然不同的抗凍蛋白氨基酸序列和組成不同，但一級(jí)結(jié) 構(gòu)具有高度的規(guī)律性，是目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最規(guī)則的蛋白。TmAFP均富含Cys和Thr，級(jí)結(jié)構(gòu)包含多個(gè)串聯(lián)重復(fù)的由12個(gè)氨基酸殘基（TCTXSXXCXXA組成的重復(fù)單位，空間 折疊形成右手B螺旋結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)形成多個(gè)二硫鍵，而氨 基酸重復(fù)單位在螺旋內(nèi)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。DAFP與8.4 kDa TmAFP在氨基酸序列上有很高的同源性， 亦富含半胱氨酸，氨基酸重復(fù)序列由 12 或 13 個(gè)氨基酸殘基 組成（CTXSXXCXXAXT。）CfAFP的氨基酸序列與前 2種AFP

16、的同源性很低，分子 內(nèi)只含有 8 個(gè)半胱氨酸，氨基酸重復(fù)序列由 15 個(gè)氨基酸殘 基組成，空間結(jié)構(gòu)為左手B 螺旋（封二彩版圖1A, B）。SfAFP（6.5 kDa由 81個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，富含Gly和Ala,4個(gè)Cys參與2個(gè)二硫鍵的形成。含特殊的三肽重復(fù)序列GlyX1 X2, X1常為Gly, X2則可以是帶電荷，親水側(cè)鏈的氨 基酸殘基或小，疏水側(cè)鏈氨基酸殘基如Ala/Val。理論模型推測(cè)分子是反平行片層結(jié)構(gòu)，2個(gè)片層分別由3個(gè)平行a 一螺旋形成（封二彩版圖2a, b）。通過(guò)對(duì) 3 種研究得比較深入的昆蟲抗凍蛋白的氨基酸序 列特征和高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面特性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)很多關(guān)鍵的殘基具有保守性，

17、這些氨基酸可能在維持抗凍蛋白結(jié)構(gòu)和功能 的完整性中發(fā)揮著重要的作用。例如，在黃粉蟲和赤翅甲的 抗凍蛋白所有的半胱氨酸都是高度保守的，都參與二硫鍵的 形成，形成穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)。2.3 相似的冰晶結(jié)合表面 目前，普遍接受的 AFP 與冰晶相互作用的機(jī)制是“吸附 抑制”理論，即 AFP特定的冰結(jié)合表面(ice binding surface, IBS與冰晶吸附結(jié)合，由于 Kelvin效應(yīng)抑制冰晶生長(zhǎng)，降低 溶液冰點(diǎn)。TmAFP和CfAFP的冰結(jié)合表面都具有重復(fù)的TXT基序，通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析和冰凍蝕刻實(shí)驗(yàn)及冰晶形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn) 證明，TXT基序均規(guī)則地分布在所形成螺圈的一個(gè)側(cè)面，能 夠與冰晶形成緊密的面對(duì)面的互補(bǔ)體。在二者的結(jié)合中 Thr 側(cè)鏈以及水分子起著關(guān)鍵作用。DAFP氨基酸重復(fù)單位中的TCT(Thr-Cys- Thr)基序亦參與形成冰晶結(jié)合表面，通過(guò)表面 互補(bǔ)作用與冰晶結(jié)合。TXT基序并不是所有昆蟲抗凍蛋白的必需結(jié)構(gòu)，這可能 是由于不同種類的昆蟲對(duì)抗凍蛋白的要求不一樣，有的昆蟲 是避免結(jié)冰的昆蟲對(duì)熱滯性要求高，而有的昆蟲雖然也能夠 產(chǎn)生抗凍蛋白，但它們可以忍受胞間結(jié)冰，所以不含TXT基序的抗凍蛋白能夠通過(guò)抑制重