煙草中非揮發(fā)性有機酸及高級脂肪酸的快速分析方法

1、煙草中非揮發(fā)性有機酸及高級脂肪酸的快速分析方法沈 軼 劉百戰(zhàn) 王 瑾 孫凱健 上海煙草（集團）公司摘 要 煙草中的有機酸及相關(guān)衍生物是影響煙草香味的主要化學(xué)成分，對于其中非揮發(fā)性有機酸及高級脂肪酸的分析一直存在著樣品處理復(fù)雜、穩(wěn)定性差等不足。本文利用對煙草制品進行連續(xù)甲酯衍生化、三氯甲烷萃取等步驟，利用GC/FID對其中的非揮發(fā)性有機酸及高級脂肪酸進行定量分析，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性、回收率等良好，具有一定的應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞 甲酯衍生化非揮發(fā)性有機酸 高級脂肪酸植物中存在多種有機酸，煙草也不例外。作為影響煙草香味的主要化學(xué)成分，對其的研究對提高煙草品質(zhì)顯得十分重要1。一般認為，煙葉中有機酸可分

2、為揮發(fā)性和非揮發(fā)性（除氨基酸外）以及部分高級脂肪酸，相對含量較高的多為非揮發(fā)性有機酸中的二元酸和三元酸，以蘋果酸、檸檬酸、草酸和丙二酸的含量相對較高（在烤煙中約占518）2。以往研究表明，一般情況下，這些非揮發(fā)性有機酸的含量高意味著香煙灰份含量大，吃味差，即與燃吸品質(zhì)呈反關(guān)系。而對于高級脂肪酸，飽和高級脂肪酸及其甲酯類能使煙氣柔滑，但不飽和高級脂肪酸及其甲酯在抽吸時會產(chǎn)生己醛、己烯醛等青雜氣物質(zhì)。故對于煙草中非揮發(fā)性有機酸、高級脂肪酸及其衍生物的測定已逐漸成為國內(nèi)外煙草行業(yè)的質(zhì)量控制內(nèi)容。對于非揮發(fā)性有機酸的分析檢測，一般可以采用高效液相色譜、離子色譜色譜、毛細管電泳等液相分離分析技術(shù)進行分析

3、檢測，但由于煙草中的化學(xué)成分過于復(fù)雜，采用液相分離和分析技術(shù)要求較高，前處理的條件和過程并不簡易26。另外，由于煙葉中有機酸部分是游離存在的，大部分是以堿金屬鹽或有機堿鹽的形式存在，采用衍生化處理，再進行氣相色譜分離分析的方法可以使檢測的準確性更高，且采用此技術(shù)還可以對煙草中的高級脂肪酸進行分離分析。現(xiàn)階段的對于非揮發(fā)有機酸和高級脂肪酸的衍生化方法主要分為硅烷化、甲酯化兩大類，可采用的衍生化試劑也相對較多，但都存在前處理過程復(fù)雜、衍生化試劑不穩(wěn)定、試劑耗用大等不足之處711。本文利用H2SO4-甲醇試劑，對煙草中的非揮發(fā)有機酸和脂肪酸進行甲酯衍生化，其主要原理是利用在酸性條件下的酯化反應(yīng)和置換

4、反應(yīng)（如圖1），使有機酸全部轉(zhuǎn)變成甲酯類化合物，然后用氯仿萃取、離心分離、利用GC/FID進行檢測，取得了較好的定量效果圖1 在H2SO4催化下的有機酸類物質(zhì)的酯化和置換反應(yīng)1 材料與方法1.1 儀器和試劑Agilent6890氣相色譜儀；氫火焰檢測器； 氯仿、甲醇（色譜純，均為Scharlau公司）；硫酸（AR，太倉教育試劑廠）；乳酸、丙二酸、乙酰丙酸、己二酸（AR，TCI公司）；草酸、蘋果酸、檸檬酸（>99，ACROS公司）；棕櫚酸甲酯（>99.5%）、硬酯酸甲酯（>97.9%）（Chem Service公司）；亞油酸甲酯、油酸甲酯（>98，Sigma公司）1.2

5、溶液的配制（1）10 H2SO4-CH3OH溶液。在冰冷卻和攪拌條件下，將100ml濃H2SO4緩慢加入900mlCH3OH溶液中，搖勻備用。（2）己二酸內(nèi)標(biāo)溶液。稱取800.0mg己二酸，加入100ml容量瓶中，用CH3OH定容至刻度。（3）標(biāo)準溶液。按表一所示準確稱取標(biāo)樣于100ml容量瓶中，用CH3OH定容至刻度。表1 標(biāo)準溶液的組成乳酸草酸丙二酸乙酰丙酸蘋果酸mg100.0500.0100.0150.02000.0檸檬酸棕櫚酸甲酯亞油酸甲酯油酸甲酯硬酯酸甲酯mg400.0350.0120.0180.0100.01.3 樣品的甲酯化 稱取100mg已粉碎的煙草樣品于具Teflon旋塞20

6、ml試管（自制）中，加入100µl己二酸內(nèi)標(biāo)溶液，加入2ml 10（V/V）硫酸甲醇溶液，振搖5min，室溫放置過夜，進行甲酯化反應(yīng)。然后加入5ml去離子水，5ml氯仿，萃取后離心（2000rpm），取下層清夜進樣。1.4 GC分析條件 DB-5（60m×0.32mm×0.25µm）毛細管色譜柱（J&W公司）；進樣量：1µL，不分流進樣方式；進樣口溫度：250；載氣：He，2.2ml/min；程序升溫：45下保持2min，然后以6/min的速率升至180，再以10/min的速率升至260，保持10min；檢測器：FID；檢測器溫度：30

7、0。2 結(jié)果與分析2.1 工作曲線的繪制分別取25、50、100、200、500µL加入具Teflon旋塞試管中，按1.3所述甲酯化程序?qū)ζ溥M行甲酯化后，進行GC/FID分析，所得色譜圖見圖2。根據(jù)保留時間定性、內(nèi)標(biāo)法定量原理得到各種酸的回歸方程及其相關(guān)參數(shù)，回歸方程以Area RatioA×AmtRatioB表示，Area Ratio為（待測酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積），AmtRatio為（待測酸含量/內(nèi)標(biāo)己二酸含量），具體數(shù)據(jù)見表2?？梢娝袠?biāo)樣的工作曲線均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)>0.999。圖3列舉了草酸和硬酯酸甲酯的工作曲線。根據(jù)工作曲線可以直接得到樣品中的非揮發(fā)

8、有機酸的含量，高級脂肪酸的實際值可以由高級脂肪酸甲酯的量換算得出。另外，根據(jù)以往的經(jīng)驗12 ，煙草中含有一定量的亞麻酸，而亞麻酸甲酯化后生成亞麻酸甲酯，其色譜峰響應(yīng)時間與油酸甲酯接近，無法分開，因此本文以油酸工作曲線計算這2種酸的重量。2.2 重復(fù)性取同一煙草樣品，按1.3所述方法進行4次有機酸測定，得到重復(fù)性測試結(jié)果，見表三。由表3可知，除檸檬酸、油酸和亞麻酸外，其他酸類成分的RSD均小于5，檸檬酸由于含有三個羧基，其衍生化過程存在一定的位阻效應(yīng)；油酸和亞麻酸由于峰的分離較困難，所以它們的測試RSD略大于5，但是還是能滿足較為可靠測試的需要的。表2 工作曲線參數(shù)和相關(guān)系數(shù)化合物AB相關(guān)系數(shù)乳

9、酸0.02602082-0.01702340.99995草酸0.2450445-0.01251770.99998丙二酸0.07335395-0.01008460.99998乙酰丙酸0.17410687-0.01368020.99994蘋果酸0.68883045-0.28979040.99999檸檬酸0.2365718-0.16262160.99999棕櫚酸甲酯0.732931010.00283410.99990亞油酸甲酯0.20098103-0.0648930.99999油酸甲酯0.30244848-0.03468870.99993硬酯酸甲酯0.23802292-0.02168370.9999

10、4圖2 標(biāo)準溶液（上）和煙草樣品（下）中非揮發(fā)有機酸和高級脂肪酸甲酯化后的氣相色譜圖1-乳酸；2-草酸；3-丙二酸；4-乙酰丙酸；5-蘋果酸；6-檸檬酸；7-棕櫚酸；8-亞油酸；9-油酸亞麻酸；10-硬酯酸；IS-內(nèi)標(biāo)（己二酸）圖3 草酸和硬酯酸甲酯測試工作曲線表3 重復(fù)性測試結(jié)果mg/g乳酸草酸丙二酸乙酰丙酸蘋果酸檸檬酸棕櫚酸亞油酸油酸+亞麻酸硬脂酸10.9510.701.200.8253.917.062.011.742.710.5221.0010.901.250.8257.567.772.081.852.980.5331.0010.811.240.8357.907.942.061.893.

11、090.5440.9710.871.240.8059.348.152.001.833.050.53RSD/%2.210.801.741.794.046.081.933.345.721.992.3 回收率 采用標(biāo)樣加入法測定方法的回收率，即在已知煙草非揮發(fā)酸和高級脂肪酸含量的煙草樣品中分別加入不同量的混合標(biāo)樣，而后進行甲酯衍生化和GC/FID分析，并根據(jù)測定量、加入量和原含量計算回收率，結(jié)果見表4。由表4可知，這10種酸的回收率在93.1118.3之間，說明本法對這些酸成分的衍生化和萃取較為完全，滿足定量分析要求。表4 非揮發(fā)有機酸和高級脂肪酸的回收率乳酸草酸丙二酸乙酰丙酸蘋果酸93.195.7

12、96.599.5110.5檸檬酸棕櫚酸亞油酸油酸亞麻酸硬酯酸118.396.9106.6110.199.63 結(jié)論簡化了煙草中非揮發(fā)有機酸和高級脂肪酸的甲酯衍生化、氣相色譜分析方法。本方法衍生化試劑消耗量小，所有操作均在同一反應(yīng)試管中完成，操作簡便、準確度高、重復(fù)性好，適用于大批量樣品的分析。參考文獻1 T.C. Tso, Production, physiology, and biochemistry of tobacco plant, IDEALS, Inc., Beltsville, MD, 19902 J. Qiu, X. Jin, Development and optimizati

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