免疫組化方法和步驟(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上免疫組化檢測(cè)CD34+的表達(dá) 1基本原理免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。威斯騰生物 400-675-6758（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.g 2.68mM KCl+0.g 1.47mM KH2PO4+7.g 8.

2、1mM Na2HPO4），115×15 min；（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ×15 min；（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 水箱中3 h多，再放入4 保存。（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；（6）DNase 1（原液1000 U/ml

3、按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）；（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）（8）20 g/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）。（9）另外，雙蒸水、無菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、蘇木素。2主要儀器設(shè)備電熱壓力蒸汽消毒器(XDD)浙江紹興醫(yī)療器械總廠超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備公司TC2323型CO2恒溫孵箱 美國SHEL LAB 公司恒溫烤箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠高速臺(tái)式離心機(jī)(BACKMAN CS-15R)美國Beckman

4、公司抽濾器( AUTOSCIENCE AP-01) 上海磁力攪拌器(79-1) 江蘇江陰科研器械廠0.22um纖維素濾膜 德國BM公司0.45um混合纖維素濾膜 德國BM公司1/10000電子天枰(Sartorius AC-211)德國細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)美國細(xì)胞計(jì)數(shù)板上海醫(yī)用儀器廠光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CK-40) 日本倒置顯微鏡（OLYMPUS) 日本照像系統(tǒng)(OLYMPUS BH-2)日本切片機(jī)： 德國Leica展片機(jī)： 德國Leica，HI1210型烤片機(jī)： 德國Leica，HI1220型3實(shí)驗(yàn)方法3.1載玻片的處理：抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因

5、素的影響，極易造成脫片。1. APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留2030秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。2. HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留12分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。3. Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫

6、過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。3.2常用酶消化：1） 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%0.1%，消化時(shí)間為37、1040分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。2） 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37、30180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。3）皂素（Saponin）：一般使用濃度為210 g/ml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。3.3抗原熱修復(fù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金

7、屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。3.3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在9298之間并持續(xù)1015分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻1020分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將

8、1500ml3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱56分鐘后），計(jì)時(shí)12分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。3.3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)9298起開始計(jì)時(shí)1520分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻2030分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，

9、下接免疫組化染色步驟。3.3 免疫組化染色步驟：1、石蠟切片脫蠟，100%二甲苯10minX 2,50%二甲苯 5min。2、復(fù)水：無水乙醇 5minX 2；95%乙醇5min；90%乙醇5min；80%乙醇5min；70%乙醇5min，蒸餾水洗滌5min。3、3%H2O2室溫孵育15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。4、PBS浸泡5分鐘×3次5、抗原修復(fù)：加入0.2%Triton X-100室溫下4分鐘，棄去液體，0.5%Triton X-100室溫下10分鐘，PBS沖洗，5分鐘×3次。6、6正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育20分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37孵育12小時(shí)或4過夜。7、PBS浸泡5分鐘×3次。8、滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37孵育30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37或室溫孵育30分鐘。9、PBS沖洗，5分鐘×3次。10、 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37孵育1030分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37或室溫孵育1030分鐘。11