秀麗隱桿線蟲(chóng)中RNA干擾作用的遺傳分析

1、秀麗隱桿線蟲(chóng)中RNA干擾作用的遺傳分析姓名 摘要：秀麗隱桿線蟲(chóng)是一種常見(jiàn)的、自由生活的小型土壤線蟲(chóng)。RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）現(xiàn)象，是研究基因功能的一種快速和高通量的方法。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)飼喂的方法，觀察外源RNA分子對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育的影響，從而了解RNA干擾的原理、特性及其應(yīng)用。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，我們達(dá)到了實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，取得了良好的?shí)驗(yàn)效果。關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲(chóng)、RNA干擾（RNAi）、飼喂法1引言秀麗隱桿線蟲(chóng)是一種常見(jiàn)的、自由生活的小型土壤線蟲(chóng)。在理想的條件下（充足食物，20）生命周期大約為4d。秀麗隱桿線蟲(chóng)成體長(zhǎng)11.5mm，體寬約70m，全身透

2、明，以細(xì)菌為食，全身共有959個(gè)細(xì)胞。研究用的通常是秀麗隱桿線蟲(chóng)野生型（N2）。從1965年開(kāi)始，Sydney Brenner以線蟲(chóng)為材料研究發(fā)育和神經(jīng)生物學(xué)，現(xiàn)在已經(jīng)成為經(jīng)典模式生物之一。線蟲(chóng)性別是由常染色體和性染色體組的比例決定，有兩種性別形式：雌雄同體和雄蟲(chóng)。雌雄同體的性染色體為XX，而雄蟲(chóng)性染色體為X0。雌雄同體的秀麗隱桿線蟲(chóng)既產(chǎn)生卵，又產(chǎn)生精子，可以與雄體交配，也可以自體受精進(jìn)行繁殖，但雌雄同體之間不能異體受精。在雌雄同體自交繁殖中以0.2%的頻率產(chǎn)生雄體（是減數(shù)分裂時(shí)性染色體不分開(kāi)造成的）；而雄體與雌雄同體交配其后代兩種性別比例為1:1。線蟲(chóng)有單基因突變形成的表型，例如：運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)

3、（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成這些表型的基因有很多個(gè)，分別分布于各條染色體上。這些易于觀察的表型作為遺傳標(biāo)記，給線蟲(chóng)的經(jīng)典遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了極大的便利。此外，線蟲(chóng)還有許多組織特異性標(biāo)記的品系。秀麗隱桿線蟲(chóng)的生命周期很短，20僅需4d。卵在通過(guò)受精囊時(shí)受精形成一層堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)的外殼，在母體內(nèi)就開(kāi)始分裂。從母體產(chǎn)出的卵大約處于30個(gè)細(xì)胞期。胚胎發(fā)生很有規(guī)律，從卵中孵化出約有550個(gè)細(xì)胞的幼蟲(chóng)。從孵化到成體，線蟲(chóng)經(jīng)歷4個(gè)幼蟲(chóng)階段（L1L4）和4次蛻皮，在身體大小和細(xì)胞數(shù)目?jī)煞矫娑加性鲩L(zhǎng)。蛻皮的時(shí)間（20）分別是孵化后13、21

4、.5、29.5和41h；身體長(zhǎng)度分別是350、470、640和890m。秀麗隱桿線蟲(chóng)孵化后約50h開(kāi)始產(chǎn)卵，每個(gè)雌雄同體可產(chǎn)200到300卵。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）現(xiàn)象，是研究基因功能的一種快速和高通量的方法。目前，在線蟲(chóng)中發(fā)展出3種不同的RNAi實(shí)驗(yàn)操作方法： 注射（injection）dsRNA；將線蟲(chóng)浸泡（soaking）于一定濃度的dsRNA溶液中； 用表達(dá)dsRNA的工程菌（E.coli）飼養(yǎng)（feeding）線蟲(chóng)。這3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中飼養(yǎng)法簡(jiǎn)單易行，適合高通量的基因功能篩選研究，已有用此

5、方法對(duì)線蟲(chóng)全基因組進(jìn)行篩選的報(bào)道。此次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)出RNAi型秀麗隱桿線蟲(chóng)的整體步驟是：提取秀麗隱桿線蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA經(jīng)過(guò)RT-PCR產(chǎn)生Gene，Gene經(jīng)過(guò)雙酶切產(chǎn)生Gene片段。另外L4440質(zhì)粒雙酶切形成線性L4440質(zhì)粒。Gene片段與線性L4440質(zhì)粒經(jīng)過(guò)T4 DNA連接酶連接形成L4440質(zhì)粒-Gene，L4440質(zhì)粒-Gene轉(zhuǎn)入到E.coli HT115（DE3）中進(jìn)行陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆后進(jìn)行PCR鑒定。之后將陽(yáng)性克隆產(chǎn)物進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)形成Gene-dsRNA，將其通過(guò)飼喂法導(dǎo)入到秀麗隱桿線蟲(chóng)，能產(chǎn)生對(duì)目的基因表達(dá)和功能的特異性干擾，從而培養(yǎng)出RNAi型秀

6、麗隱桿線蟲(chóng)。2材料和方法2.1 材料、試劑和器材實(shí)驗(yàn)材料：秀麗隱桿線蟲(chóng)野生型（N2）、大腸桿菌OP50、大腸桿菌HT115（DE3）、6種不同的RNA干擾菌株HT115（含有能表達(dá)不同gene dsRNA的質(zhì)粒，對(duì)應(yīng)的性狀編號(hào)分別為：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）實(shí)驗(yàn)試劑：LB液體培養(yǎng)基、NGM固體培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)體顯微鏡、顯微鏡、粘蟲(chóng)器（pick）、培養(yǎng)皿、錐形瓶、微量移液器、藍(lán)槍頭、黃槍頭、白槍頭、記號(hào)筆、酒精燈、火柴、高壓蒸汽滅菌鍋、封口膜2.2 方法2.2.1活化大腸桿菌OP50打開(kāi)超凈工作臺(tái)的紫外燈5min，之后關(guān)閉紫外燈開(kāi)始無(wú)菌操作。取一個(gè)滅菌后

7、的15mL離心管，用微量移液器向其加入3mL LB液體培養(yǎng)基，再向其中加入300L大腸桿菌OP50。將15mL離心管放入37恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（812h）。2.2.2 大腸桿菌OP50涂平板大腸桿菌OP50振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的紫外燈5min，之后關(guān)閉紫外燈開(kāi)始無(wú)菌操作。用微量移液器取200L菌液加入到NGM培養(yǎng)基平板中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)平板使菌液散開(kāi)，用封口膜將平板封口。將接種后的平板置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)67小時(shí)。2.2.3 向NGM培養(yǎng)基平板中接種線蟲(chóng)從老師提供的線蟲(chóng)培養(yǎng)板中選取有卵的或者L1、L2期雌雄同體線蟲(chóng)（生長(zhǎng)時(shí)期保證一致），用粘蟲(chóng)器（pick）挑取這些線蟲(chóng)接種到NGM培

8、養(yǎng)基平板中，用封口膜將平板封口。記錄接種的線蟲(chóng)所處的生長(zhǎng)時(shí)期和接種時(shí)間，根據(jù)線蟲(chóng)生長(zhǎng)時(shí)期與溫度的關(guān)系與自己的實(shí)際時(shí)間情況合理確定線蟲(chóng)培養(yǎng)方案，選擇在不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱（20和25）中的培養(yǎng)時(shí)間，將線蟲(chóng)培養(yǎng)至第四幼蟲(chóng)期（L4期線蟲(chóng)）。2.2.4 活化干擾菌株和涂干擾板在步驟2.2.3進(jìn)行的期間，要進(jìn)行活化干擾菌株和涂干擾板。打開(kāi)超凈工作臺(tái)的紫外燈5min，之后關(guān)閉紫外燈開(kāi)始無(wú)菌操作。取7個(gè)滅菌后的15mL離心管，用微量移液器向其中加入3mL LB液體培養(yǎng)基和3L Amp，再分別加入300Lbli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2和lon6種干擾菌株以及陰性對(duì)照HT115菌株，用微

9、量移液器吹吸混勻。將這7個(gè)15mL離心管做好標(biāo)記，放入37恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（1216h）。之后取7個(gè)NGM培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)中，用微量移液器分別取200300L 7種活化好的菌液加入到NGM培養(yǎng)基平板中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)平板使菌液散開(kāi)，用封口膜將平板封口，在平板的皿底和皿蓋上同時(shí)做好標(biāo)記。將干擾板置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)616小時(shí)。此步驟要求這7個(gè)干擾板接種的菌株培養(yǎng)好的時(shí)間與步驟2.2.3中將線蟲(chóng)培養(yǎng)至第四幼蟲(chóng)期（L4期線蟲(chóng)）的時(shí)間一致。2.2.5向7個(gè)干擾板中挑取L4期線蟲(chóng)步驟2.2.4中7個(gè)干擾板接種的菌株培養(yǎng)好后，步驟2.2.3中的線蟲(chóng)也培養(yǎng)至第四幼蟲(chóng)期（L4期線蟲(chóng)）。此時(shí)用粘蟲(chóng)器

10、（pick）分別向7個(gè)干擾板中挑取10條L4期雌雄同體線蟲(chóng)，用封口膜將平板封口。挑取線蟲(chóng)后將干擾板置于20恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。2.2.6 挑取45條L4期雌雄同體線蟲(chóng)到新的干擾板中2d后挑取45條L4期雌雄同體線蟲(chóng)到新的干擾板中，用封口膜將平板封口。與原干擾板共同置于20恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。2.2.7 觀察兩個(gè)干擾板中的后代表型，統(tǒng)計(jì)突變型出現(xiàn)的頻率3結(jié)果此次實(shí)驗(yàn)中使用了6種不同的RNA干擾菌株HT115（含有能表達(dá)不同gene dsRNA的質(zhì)粒），對(duì)應(yīng)的性狀編號(hào)分別為：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon。同時(shí)還使用了起陰性對(duì)照作用的RNA干擾菌株HT115，即

11、轉(zhuǎn)入了RNA干擾質(zhì)?？蛰d體L4440的HT115。（1）接種了RNA干擾菌株HT115的平板起陰性對(duì)照的作用，線蟲(chóng)不發(fā)生突變。如圖一所示。圖一 陰性對(duì)照的平板中線蟲(chóng)不發(fā)生突變圖一中的線蟲(chóng)都是雌雄同體線蟲(chóng)，個(gè)體比雄蟲(chóng)稍大，產(chǎn)卵器位于身體的中部，體內(nèi)可見(jiàn)卵或胚胎。圖二是在10×低倍鏡下觀察的HT115陰性對(duì)照線蟲(chóng)。圖二10×低倍鏡下觀察的HT115陰性對(duì)照線蟲(chóng)（2）接種了bli-2干擾菌株的干擾板中，線蟲(chóng)可以發(fā)生性狀突變，突變特征是成蟲(chóng)身上表皮起泡（尤其是頭部），線蟲(chóng)比野生型稍小。如圖三所示。圖三 接種bli-2干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)圖三中可以很明顯地觀察到突變線蟲(chóng)頭部表皮

12、起泡。（3）接種了dpy-2干擾菌株的干擾板中，線蟲(chóng)可以發(fā)生性狀突變，突變特征是成蟲(chóng)粗短，身體向左轉(zhuǎn)彎，身體僵硬，幼蟲(chóng)正常。如圖四所示。圖四 接種dpy-2干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)圖四中可以很明顯地觀察到突變線蟲(chóng)粗短，身體向左轉(zhuǎn)彎，身體僵硬。（4）接種了dpy-5干擾菌株的干擾板中，線蟲(chóng)可以發(fā)生性狀突變，突變特征是成蟲(chóng)非常粗短，幼蟲(chóng)正常。如圖五所示。圖五 接種dpy-5干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng)AB圖五中“A”是突變線蟲(chóng)，“B”是未突變線蟲(chóng)（即野生型線蟲(chóng)）。二者對(duì)比可以很明顯地看出突變性狀。圖六是在10×低倍鏡下觀察接種dpy-5干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng)。

13、A圖六10×低倍鏡下接種dpy-5干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng)BC圖六中“A”是未突變線蟲(chóng)（即野生型線蟲(chóng)），“B”和“C”是突變線蟲(chóng)。二者對(duì)比可以很明顯地看出突變性狀。（5）接種了him干擾菌株的干擾板中，線蟲(chóng)可以發(fā)生性狀突變，突變特征是在干擾板中雄蟲(chóng)出現(xiàn)率提高。如圖七所示。ABCDE圖七 接種him干擾菌株的干擾板中雄蟲(chóng)和雌雄同體線蟲(chóng)圖七中“A”和“B”是雄蟲(chóng)，“C”、“D”和“E”是雌雄同體線蟲(chóng)。雄蟲(chóng)比雌雄同體線蟲(chóng)身體細(xì)、顏色淺，尾部的交配器呈扇形（三角形）。不過(guò)雖然接種了him干擾菌株的干擾板中雄蟲(chóng)出現(xiàn)率提高，但是雄蟲(chóng)出現(xiàn)的頻率仍然較低。圖八是在10×低倍鏡

14、下觀察接種him干擾菌株的干擾板中雄蟲(chóng)和雌雄同體線蟲(chóng)。圖八10×低倍鏡下觀察接種him干擾菌株的干擾板中雄蟲(chóng)和雌雄同體線蟲(chóng)ABCD圖八中“A”是雄蟲(chóng)，“B”、“C”和“D”是雌雄同體線蟲(chóng)。圖中可以很明顯地看出雄蟲(chóng)比雌雄同體線蟲(chóng)身體細(xì)、顏色淺，尾部的交配器由于被雌雄同體線蟲(chóng)擋住無(wú)法觀察到扇形（三角形）。還可以看到雄蟲(chóng)體內(nèi)的消化管和儲(chǔ)精管。（6）接種了sma-2干擾菌株的干擾板中，線蟲(chóng)可以發(fā)生性狀突變，突變特征是線蟲(chóng)比野生型短小。如圖九所示。圖九 接種sma-2干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng) AB實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，突變線蟲(chóng)比野生型線蟲(chóng)短小的性狀并不明顯，較難觀察。圖九中“A”（突變線蟲(chóng)

15、）和“B”（未突變線蟲(chóng)）兩只線蟲(chóng)對(duì)比可以較清楚地觀察出突變性狀。（7）接種了lon干擾菌株的干擾板中，線蟲(chóng)可以發(fā)生性狀突變，突變特征是線蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育階段均較野生型長(zhǎng)，頭部和尾部變尖。如圖十所示。圖十 接種lon干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng)AB實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，突變線蟲(chóng)比野生型線蟲(chóng)長(zhǎng)的性狀并不明顯，較難觀察。圖十中“A”（突變線蟲(chóng)）和“B”（未突變線蟲(chóng)）兩只線蟲(chóng)對(duì)比可以較清楚地觀察出突變性狀。圖十一是在10×低倍鏡下觀察接種lon干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng)。圖十一10×低倍鏡下觀察接種lon干擾菌株的干擾板中突變線蟲(chóng)和未突變線蟲(chóng)ABC實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，突變線蟲(chóng)比野生型

16、線蟲(chóng)長(zhǎng)的性狀并不明顯，較難觀察。圖十一中“A”（突變線蟲(chóng)）和“B”、“C”（未突變線蟲(chóng)）的對(duì)比可以較清楚地觀察出突變性狀。4討論RNAi是一個(gè)奇特的生物現(xiàn)象，在許多物種中特殊的dsRNA的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解使得該基因的功能幾乎完全喪失。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)可以方便的找出突變的表型而不必去費(fèi)力的分離一個(gè)突變的基因本從而大大加快了研究的進(jìn)程。RNA干擾機(jī)制是如下所示：第一步（起始階段），dsRNA在內(nèi)切核酸酶（Dicer酶）作用下加工裂解形成2123nt的siRNA；第二步（效應(yīng)階段），是由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing compl

17、ex，RISC），由RISC介導(dǎo)切割靶向mRNA分子中與siRNA互補(bǔ)的區(qū)域，從而達(dá)到干擾基因表達(dá)的作用。秀麗隱桿線蟲(chóng)的RNAi方法有顯微注射法、浸泡法和飼喂法。顯微注射法是最初的RNA干擾試驗(yàn)采用的經(jīng)典方法，是通過(guò)直接注射dsRNA到雌雄同體線蟲(chóng)的生殖器官，然后檢查它親代以及后代的表型。它的不足之處在于效率低，不適合用此法進(jìn)行高通量篩選，同時(shí)干擾效果會(huì)隨著細(xì)胞分裂而不斷降低，不適合進(jìn)行晚期表達(dá)基因研究。浸泡法是將線蟲(chóng)浸泡在dsRNA溶液中，但是干擾成功率不高。飼喂法是給線蟲(chóng)飼喂表達(dá)dsRNA的大腸桿菌，從而產(chǎn)生RNA干擾效果，該方法成功率近似于微注射，可大批量培養(yǎng)，成本低，主要的缺點(diǎn)是需要在

18、細(xì)菌中表達(dá)dsRNA。目前已有86%的線蟲(chóng)基因有現(xiàn)成的菌株可用。此次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)出RNAi型秀麗隱桿線蟲(chóng)的整體步驟是：提取秀麗隱桿線蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA經(jīng)過(guò)RT-PCR產(chǎn)生Gene，Gene經(jīng)過(guò)雙酶切產(chǎn)生Gene片段。另外L4440質(zhì)粒雙酶切形成線性L4440質(zhì)粒。Gene片段與線性L4440質(zhì)粒經(jīng)過(guò)T4 DNA連接酶連接形成L4440質(zhì)粒-Gene，L4440質(zhì)粒-Gene轉(zhuǎn)入到E.coli HT115（DE3）中進(jìn)行陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆后進(jìn)行PCR鑒定。之后將陽(yáng)性克隆產(chǎn)物進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)形成Gene-dsRNA，將其通過(guò)飼喂法導(dǎo)入到秀麗隱桿線蟲(chóng)，能產(chǎn)生對(duì)目的基因表達(dá)和功能的特異

19、性干擾，從而培養(yǎng)出RNAi型秀麗隱桿線蟲(chóng)。本實(shí)驗(yàn)所用的載體是L4440 T7雙鏈載體，大小是2790bp。該載體含有Amp抗性基因，可以在含有Amp的NGM平板中生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用的RNA干擾菌株是HT115（DE），其中有一個(gè)Rnc基因突變，使得特異性降解dsRNA的內(nèi)切酶RNase的基因失活，這樣有利于dsRNA的形成，可穩(wěn)定表達(dá)目的基因dsRNA。另外，此菌株中含有DE3 lysogen，它可在T7啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄。此次實(shí)驗(yàn)中使用了6種不同的RNA干擾菌株HT115（含有能表達(dá)不同gene dsRNA的質(zhì)粒），對(duì)應(yīng)的性狀編號(hào)分別為：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sm

20、a-2、lon。同時(shí)還使用了起陰性對(duì)照作用的RNA干擾菌株HT115，即轉(zhuǎn)入了RNA干擾質(zhì)粒空載體L4440的HT115。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中還有以下幾個(gè)方面需要注意：（1）LB液體培養(yǎng)基的配制方法：配方：胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母粉提取物5g/L。用蒸餾水配制，配好后置于高壓蒸汽滅菌鍋中121滅菌15分鐘。（2）NGM培養(yǎng)基的配制方法：配制150mL NGM培養(yǎng)基：NaCl 0.45g、Agur 2.6g、Tryptone0.375g、ddH2O146mL，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋中120滅菌15分鐘。然后在無(wú)菌條件下加入下列滅菌的溶液：CaCl2（1M）0.15mL、MgSO4（1M） 0.15mL、磷酸緩沖液（1M，pH=6）3.7