Car-T細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程(共3頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上Car-T細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程1 目的：保證Car-T細(xì)胞制備和培養(yǎng)符合要求。2 范圍：適用于符合實(shí)驗(yàn)的要求患者外周血制備和培養(yǎng)3 責(zé)任人：實(shí)驗(yàn)員人、臨床相關(guān)人員。4 內(nèi)容4.1耗材：50ml離心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培養(yǎng)瓶，150 cm2培養(yǎng)瓶，EP管，1.8ml凍存管4.2試劑：X-VIVO 15TM，PBS緩沖液，75%醫(yī)用酒精，人淋巴細(xì)胞分離液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。4.3環(huán)境：4.3.1外周血分離，培養(yǎng)應(yīng)在恒溫恒濕的萬(wàn)級(jí)層流室內(nèi)進(jìn)行，開放操作必須在百級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。4.3.2實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)提前對(duì)凈化室和生

2、物安全柜進(jìn)行殺菌消毒，紫外線照射時(shí)間不少于30min，消毒消毒后，凈化空調(diào)開啟時(shí)間不少于30min，生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)定后方可操作。4.4操作：4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治療方案，各項(xiàng)檢測(cè)符合要求，采集患者外周血60-80ml。4.4.1.2接收外周血并填寫外周血采集交接記錄，核對(duì)外周血患者相關(guān)信息，及相應(yīng)檢測(cè)報(bào)告，報(bào)告由醫(yī)院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。4.4.2操作前準(zhǔn)備4.4.2.1凈化室，生物安全柜消毒完畢后，開啟凈化空調(diào)運(yùn)行30min，生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)定。4.4.2.2從試劑間冰箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)基，恢復(fù)室溫。4.4.2.

3、3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒轉(zhuǎn)入安全柜內(nèi)。4.4.3  分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：4.4.3.1使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋內(nèi)外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中。4.4.3.2用PBS緩沖液按1:1稀釋外周血，混勻。4.4.3.3將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的15ml人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血樣，伸至分離液液面上方0.5cm處，血樣自然滑落鋪至分離液面上，然后輕輕加入血樣，注意不要沖破液面。4.4.3.4配平離心1200g（2100r/min）離心20min，慢升慢降。4.4.3.5離心完成后，離心管出

4、現(xiàn)明顯分層由下至上：紅細(xì)胞層，粒細(xì)胞層，F(xiàn)icoll層，單個(gè)核細(xì)胞層和血漿層。吸取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之。小心吸取紅細(xì)胞層以上的所有液體至離心管中，PBS稀釋，與細(xì)胞懸液體積比應(yīng)大于1:3，混勻。4.4.3.6離心600g（1600r/min）5min，PBS重懸細(xì)胞混勻，取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。4.4.3.7離心300g（1200r/min）5min，上清液送檢無(wú)菌檢測(cè)。4.4.4細(xì)胞培養(yǎng)：4.4.4.1細(xì)胞培養(yǎng)條件：恒溫37，CO2濃度 5%，相對(duì)飽和濕度95%，細(xì)胞培養(yǎng)基PH值7.2-7.4。4.4.4.2根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)密度2x106/ml加入培養(yǎng)瓶中（T150 200x106/100

5、ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)。4.4.4.3取出培養(yǎng)瓶，輕搖，使沉降于底部的懸浮細(xì)胞浮起，培養(yǎng)瓶?jī)A斜30度角，移液管吸取培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入離心管中，少些培養(yǎng)基洗培養(yǎng)瓶將懸浮細(xì)胞全部收集，混勻計(jì)數(shù)。4.4.4.4根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度1.2x106/ml接種培養(yǎng)瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按細(xì)胞與磁珠比例為1:3（加之前磁珠用培養(yǎng)基洗滌3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4

6、.4.4.5次日細(xì)胞培養(yǎng)1天，調(diào)整細(xì)胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI為1-5）混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.4.4.6細(xì)胞培養(yǎng)3天，細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基，IL-2  100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.7細(xì)胞培養(yǎng)5天去磁珠，細(xì)胞混勻轉(zhuǎn)離心管中，在磁力架上去除磁珠，細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基，IL-2  100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.8定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，主要觀察其形態(tài)的變化，數(shù)目及增值情況，細(xì)胞碎片及雜質(zhì)情況，每2-3天加液培養(yǎng)。4.4.4.9根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和臨床治療需要，培養(yǎng)9天時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到要

7、求，各項(xiàng)檢測(cè)合格。包括：無(wú)菌檢測(cè)，內(nèi)毒素檢測(cè)，細(xì)胞活力，細(xì)胞表型等。4.4.5 Car-T細(xì)胞收集：4.4.5.1確認(rèn)細(xì)胞各項(xiàng)檢測(cè)己符合要求。4.4.5.2根據(jù)治療方案（一般一個(gè)療程分多次回輸，間隔時(shí)間為1天），取出相應(yīng)細(xì)胞懸液，剩余細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，供再次回輸。4.4.5.3細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，300g離心5min。4.4.5.4除去上清培養(yǎng)液，加PBS緩沖液稀釋混勻，300g離心5min，棄上清，PBS緩沖液300g/min離心5min。4.4.5.5細(xì)胞裝袋（一般靜脈回輸，采用100ml雙閥鹽水袋），離心完成后取上清，做無(wú)菌檢測(cè)，20ml生理鹽水重懸細(xì)胞，100m細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞活率，革蘭氏檢測(cè)，內(nèi)毒素檢測(cè)。細(xì)胞過濾完成，轉(zhuǎn)入100ml鹽水袋中，加5%注射用人血白蛋白，貼上標(biāo)簽，并填寫相關(guān)記錄。4.5細(xì)胞運(yùn)輸與保存：4.5.1核對(duì)細(xì)胞標(biāo)簽內(nèi)容，填寫回輸發(fā)放記錄。4.5.2細(xì)胞鹽水袋放置于運(yùn)輸容器內(nèi)（一般