去鐵敏對損傷脊髓一氧化氮合酶表達的影響

1、去鐵敏對損傷脊髓一氧化氮合酶表達的影響【摘要】目的研究去鐵敏（DFO）對急性脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能保護作用及對3種一氧化氮合酶（NOS）亞型表達的影響。方法利用Allens打擊模型，致傷力為25gcf(10g2.5cm)，選用SD大鼠36只，隨機分為3組（n12）：空白組（C組）；脊髓損傷組（生理鹽水組,S組）；去鐵敏治療組（DFO組）。分別于傷后4小時取材，免疫組化方法檢測3種NOS亞型的表達情況，并于傷后5周行BBB評分。結(jié)果DFO組及S組傷后上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05或P0.01）。結(jié)論去鐵敏通過阻斷鐵離子引發(fā)的脊髓組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而減輕脊髓組織的炎癥反應(yīng)，減少誘導(dǎo)型NO

2、S（iNOS）的表達；并通過減輕脊髓組織細胞內(nèi)鈣超載，降低固有型NOS（cNOS）的活性，減少了脊髓組織的繼發(fā)損傷程度。 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷；去鐵敏；一氧化氮合酶；脂質(zhì)過氧化反應(yīng)Protective effect of desferrioxamine on the NOS expression after SCI in rat LIANG Chaoge，TAO Kun，ZUO Xuemei，et al. Department of Orthopaedics,Shanghai Changning Center District Hospital,Shanghai200336，China Abs

3、tract：ObjectiveThe aim of this study is to assess the neuroprotective effect of desferrioxamine and the effect of which on the 3 NOS in secondary lesion after SCI in rat.MthodsContusion model of SCI using the modified Allens method that resulted in rats with incomplete paraplegia was used.Thirtysix

4、rats were divided into three groups(n=12): control group(C group),SCI group(S group),desferrioxamine group(DFO group).Four hours after trauma,activity of iNOS,nNOS and eNOS had been measured using immunohistochemistry methods in the lesion of spinal cord.The functional status was assessed using Bass

5、oBeattieBresnehan(BBB) locomotor rating scale in the fifth week（C group）.ResultsThere were significant differences in the activity of iNOS,nNOS,the functional status between C group and the other 2 groups,and there were significant differences in eNOS between S group and C group.There were significa

6、nt differences in the factors abovementioned between DFO group and S group.ConclusionThe neuroprotective effect of DFO is that DFO can reduce the expression of 3 NOS by inhibiting lipid peroxidation,inflammatory reaction and calcium overload. New therapeutic strategies for SL prevention, based on th

7、e modulation of 3NOS, will be evaluated. Key words:spinal cord injury;desferrioxamine;NOS;lipid peroxidation 脊髓損傷后，多種因素參與了脊髓的繼發(fā)損傷過程。研究顯示1，脊髓損傷后游離鐵濃度迅速升高，觸發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。同時，脊髓損傷后，由于局部缺血、能量代謝障礙、興奮性氨基酸積聚及細胞去極化，致鈣離子大量向細胞內(nèi)流動，可使一氧化氮合酶（NOS）活性增高使局部一氧化氮（NO）產(chǎn)生增多，加重脊髓組織的繼發(fā)損傷。本研究通過建立大鼠脊髓損傷打擊模型，觀察去鐵敏對損傷后脊髓組織中3種NOS活性的影

8、響，及其對脊髓組織的保護作用。材料與方法 1實驗動物分組與試劑 健康封閉群SD大鼠36只（復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心提供），體重（26030）g，隨機分為3組(n12)：空白組（C組），行椎板切除不損傷脊髓；去鐵敏治療組（DFO組），損傷后15分鐘腹腔注射30mg/kg；對照組（SAL，S組），損傷后注射等量的生理鹽水。去鐵敏購于諾華制藥公司，3種NOS試劑購于武漢博士德公司。 2大鼠脊髓損傷模型制備 按改良Allens撞擊法2制作大鼠脊髓不完全損傷模型。大鼠稱重后，用戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉，俯臥位固定，背部剪毛，10%活力碘消毒，鋪洞巾，以T10棘突為中心取背部正中切口（約5cm），

9、顯露T612棘突及椎板。用特制手術(shù)鉗咬除相應(yīng)節(jié)段棘突及全椎板，以脊髓為中心顯露直徑約2.8mm圓形區(qū)，在硬膜表面墊一彎曲度與脊髓表面一致的塑料墊片，用直徑12.4mm、重10g的圓柱狀金屬棒在細玻璃管的引導(dǎo)下從2.5cm高處垂直落下，打擊墊片致脊髓急性挫傷，致傷力為25gcf(10g2.5cm)，脊髓損傷成功后逐層縫合切口。術(shù)后以恒溫電毯保持肛溫(370.5) ，精心飼養(yǎng)，不限飲水及進食，人工膀胱排尿3次/d，直至恢復(fù)排尿功能。對照組僅行椎板切除，不損傷脊髓。損傷后4小時各組取6只處死，多聚甲醛灌注，石蠟包埋行免疫組化檢查；其余6只于損傷后5周行BBB評分。 3指標(biāo)測定 3.1免疫組化免疫組化

10、染色：將蠟塊連續(xù)切片（厚度為7m），脫蠟、水化組織切片，CD117熱修復(fù)，蒸餾水漂洗，置于Tris緩沖生理鹽水（TBS）中，滴加3過氧化氫（H2O2）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育10分鐘，蒸餾水漂洗，置于TBS，10分鐘。一抗孵育30分鐘，TBS漂洗10分鐘，EnVision二步法二抗孵育30分鐘，TBS漂洗10分鐘，底物溶液3，3二氨基聯(lián)苯胺（DAB）孵育顯色，光鏡下控制顯示結(jié)果，蒸餾水漂洗。免疫結(jié)果分析：從各組隨機選取5張切片，每張切片隨機選取5個不同重疊視野，采用華東理工大學(xué)自動化所細胞免疫組織化學(xué)分析系統(tǒng)Version2.0自動分析儀記錄陽性細胞百分率。 3.2BBB評分采用BBB評分法

11、3。評定區(qū)域為直徑100cm的圓形區(qū)域，地面為光滑塑料。大鼠脊髓損傷后5周由熟悉該評分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實驗人員進行測定。 4統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)行SPSS10.0軟件處理，以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗，3組比較采用單因素Anova分析，檢驗結(jié)果以P0.05為統(tǒng)計學(xué)相差顯著，P0.01為相差非常顯著。 結(jié)果 3種NOS免疫組化：S組中iNOS呈陰性表達，內(nèi)皮細胞型NOS（nNOS）表達同其他兩組比較有極顯著差異（P0.01），神經(jīng)型NOS（eNOS）表達同C組比較差異顯著（P0.05）；DFO組同C組比較，iNOS、nNOS和eNOS表達均顯著降低（P0.05或P0.01），詳見表1

12、及圖13。BBB評分：脊髓損傷后5周，DFO組BBB評分高于C組（見表1）。表1傷后4小時組脊髓組織3種NOS含量及傷后5周BBB評分情況（略）討論 1游離鐵在脊髓繼發(fā)損傷中的作用 鐵代謝對脊髓組織的功能活動極為重要，但高濃度的游離鐵離子存在于細胞內(nèi)或細胞周圍卻是非常有害的。脊髓損傷后，由于各種原因?qū)е录顾杞M織的損傷，細胞死亡，質(zhì)膜破損，從而導(dǎo)致“催化性”鐵離子的釋放，而鐵離子會催化活性氧自由基的產(chǎn)生，進一步加重脊髓組織的損傷。Liu等4發(fā)現(xiàn)，在脊髓繼發(fā)損傷的早期階段羥基鐵離子起著非常重要的作用。 2脊髓損傷后NOS的變化規(guī)律 NOS有3種異構(gòu)體，分別為eNOS、nNOS和iNOS。eNOS、

13、nNOS合稱固有型一氧化氮合酶(cNOS)。cNOS的活性為鈣依賴性，在正常生理條件下，催化合成基礎(chǔ)量的NO，抑制血小板聚集和黏附，從而維持血管舒張狀態(tài)，保持組織器官血流量在生理水平；iNOS的活性為非鈣依賴性，正常生理狀態(tài)下含量極微，而脊髓損傷后須經(jīng)炎癥介質(zhì)或細胞因子等誘導(dǎo)，產(chǎn)生的NO量大、持續(xù)時間長，可通過直接引起過氧化損傷或作為信號介質(zhì)介導(dǎo)其它炎癥因子加重脊髓繼發(fā)損傷。有關(guān)脊髓傷后iNOS的表達規(guī)律及作用文獻報道是一致的，但有關(guān)eNOS、nNOS的報道卻大相徑庭。劉成龍等5研究表明，脊髓損傷后nNOSmRNA表達迅速增強，在傷后6小時達到高峰，nNOS參與了繼發(fā)性脊髓損傷過程，并可能是一

14、種損傷因素。DiazRuiz等6研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓損傷4小時后，nNOS和eNOS活性明顯增強。Vaziri等7研究發(fā)現(xiàn)nNOS在脊髓損傷后1天未見明顯變化，而在損傷后14天表達明顯下降，認為eNOS和iNOS在脊髓繼發(fā)損傷中起著重要作用，而同nNOS無關(guān)。Miscusi等8發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓損傷15分鐘后，nNOS活性降低，未見eNOS表達。Sharma等9通過切斷T1011節(jié)段脊髓背角建立大鼠脊髓損傷模型，發(fā)現(xiàn)在臨近損傷的T9和T12，cNOS活性明顯增強，而在損傷節(jié)段iNOS活性明顯增強，認為cNOS和iNOS均參與了脊髓的繼發(fā)損傷。Chatzipanteli等10建立大鼠T10節(jié)段脊髓

15、打擊模型，發(fā)現(xiàn)在傷后3、6、24小時損傷節(jié)段cNOS活性明顯降低，在損傷后3小時臨近節(jié)段cNOS亦明顯降低，在T8節(jié)段cNOS 活性恢復(fù)到S組水平在傷后6小時在T8、T11 、T12節(jié)段，傷后1天在T10和T9節(jié)段恢復(fù)正常水平。iNOS 在各個節(jié)段及時段均明顯增強，作者認為，cNOS和iNOS在脊髓損傷后的的活性成區(qū)域性及時段性變化。在本研究中，C組與DFO組中iNOS和nNOS表達均顯著升高，同C組比較差異顯著，但DFO組eNOS表達同S組比較無顯著差別。我們認為，之所以會出現(xiàn)在脊髓傷后cNOS變化不一致的結(jié)果可能同實驗?zāi)Ｐ图皞髸r間點的選擇不同有關(guān)。 3DFO對脊髓的保護作用及對3種NOS

16、表達的影響 脊髓損傷后，鈣離子大量內(nèi)流，可使cNOS活性增高，同時由于炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)iNOS產(chǎn)生，使局部NO產(chǎn)生增多，從而加重脊髓組織的損傷，同時，脊髓組織損傷后，鐵離子濃度增高，鐵離子除了參與活性氧的產(chǎn)生外，自身在氧化還原過程中所形成的與氧結(jié)合的復(fù)合物也能引起脂質(zhì)過氧化并改變細胞內(nèi)鈣離子的濃度11。去鐵敏是一種高選擇性的鐵離子絡(luò)合劑，它對三價游離鐵的絡(luò)合作用很強，1分子的去鐵敏能結(jié)合3分子的鐵離子，使活性鐵濃度降低或使游離的鐵得以清除。在本研究中，經(jīng)去鐵敏治療后，脊髓組織游離鐵的濃度、及MDA含量均明顯下降，iNOS、cNOS免疫活性均低于S組，5周BBB評分高于S組。已有研究3證實，去鐵敏

17、能明顯地降低脊髓組織損傷后由鐵離子引發(fā)的脊髓組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，但其對脊髓損傷后DFO對NOS表達的影響的研究卻未見報道，在本研究中，DFO可使傷后NOS活性降低，其可能機制為：（1）通過阻斷鐵離子引發(fā)的脊髓組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而減輕脊髓組織的炎癥反應(yīng)，減少iNOS的表達；（2）通過減輕脊髓組織細胞內(nèi)鈣超載，降低cNOS的活性，并從而從另一途徑減少了脊髓組織的繼發(fā)損傷程度?！緟⒖嘉墨I】 1劉錦波,唐天駟,肖德生,等.游離鐵在實驗性脊髓損傷后的動態(tài)變化及意義J.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2002,24(4):206-208.2Freeman LW,Wright GW.Experimental obs

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