UPLC(超高效液相色譜)MSMS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定全血中的西羅莫司

1、UPLC(超高效液相色譜)/MS/MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定全血中的西羅莫司(1)        作者：祝仕清 牛長(zhǎng)群 耿亞鵬 【摘要】 目的 建立全血中西羅莫司的UPLC(超高效液相色譜)/MS/MS測(cè)定方法。方法 全血樣品中加入他克莫司(FK506)作內(nèi)標(biāo)，用叔丁基甲醚進(jìn)行提取。以乙腈與含千分之五甲酸的水溶液為流動(dòng)相(4050)，色譜柱為Acquity UPLCTM BEH C8(50mm×2.1mm，1.7m)，流速0.5ml/min。三重四極桿質(zhì)譜采用正離子模式，離子采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，離子

2、源溫度105，離子源電離電壓為3300V，霧化氣流速500L/h。采集離子(母離子/子離子)西羅莫司為931.2/864.1，F(xiàn)K506為822.0/577.0。結(jié)果 西羅莫司在1240g/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性(r=0.9995)。日內(nèi)、日間精密度均在15%以內(nèi)，提取回收率大于75.0%，方法回收率為95.0%98.5%，最低檢測(cè)限為0.2g/L。結(jié)論 本方法靈敏、準(zhǔn)確，適合臨床西羅莫司的全血分析。 【關(guān)鍵詞】 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 血藥濃度 西羅莫司    Determination of sirolimus in whole blood by

3、UPLC/MS/MS    ABSTRACT Objective To establish a UPLC/MS/MS method for the detemination of sirolimus in whole blood. Methods The blood sample was extracted with methyl tertbutyl ether and separated over an ACQUITY UPLCTM BEH C8 (50mm×2.1mm, 1.7m). The mobile phase consisted o

4、f a mixture of water (0.5% formic acid) and acetonitrile (5040). The flow rate was 0.5ml/min. Tacrolimus (FK506) was used as an internal standard. The triple quadrupole mass spectrometer with the turbo ion spray interface was operated in the positive ion mode and the temperature of the turbo was set

5、 at 105 and the ionization voltage was 3300V. The multireaction monitoring (MRM) mode was employed to scan the ions. The selected ions (precursorion/product ion) were 931.2/864.1 for sirolimus and 822.0/577.0 for FK506. Results The calibration linear range of bloodsirolimus concentrations was 1 to 2

6、40 g/L (r=0.9995). The betweenday and withinday RSD% were less than 15%. The extraction recoveries were more than 75.0% and the method recoveries were between 95.0% and 98.5%. The low limit of detection was 0.2g/L. Conclusion The UPLC/MS/MS method is rapid, sensitive and reliable and can be applied

7、to monitor sirolimus of whole blood.    KEY WORDS UPLC/MS/MS; Whole blood; Sirolimus    西羅莫司(sirolimus)是一種新型、強(qiáng)效大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，由于治療用劑量低(0.010.3mg/kg)，個(gè)體差異大，治療指數(shù)窄，特別對(duì)特殊患者(兒童，肝功能不良者)血藥濃度監(jiān)測(cè)是非常必要的。另外，由于西羅莫司免疫抑制作用與穩(wěn)定態(tài)的谷濃度(Cmin)相關(guān)，需要靈敏的檢測(cè)方法。超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)作為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分離技術(shù)，

8、與傳統(tǒng)的液相色譜相比具有更高的分離效率和更快的分離速度，尤其與質(zhì)譜聯(lián)用更能顯示其優(yōu)越的性能，本文采用UPLC/MS/MS方法分析檢測(cè)血中西羅莫司的濃度。該方法的靈敏度高(最低檢測(cè)限為0.2g/L)，分離速度快，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的LC/MS/MS測(cè)定法13。    1 材料與方法    1.1 儀器    美國(guó)Waters液質(zhì)聯(lián)用儀，AcquityTM超高效液相色譜(Ultra performance LC)系統(tǒng)； Quattro PremierMICROMASS質(zhì)譜儀，MsssL

9、ynx工作站；十萬(wàn)分之一電子分析天平(Sartorius)。    西羅莫司對(duì)照品(華北制藥新藥中心試制)；他克西司(FK506，華北制藥新藥中心提供)；叔丁基甲醚、甲醇及乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。    1.2 溶液的配制    西羅莫司溶液 精密稱取西羅莫司對(duì)照品10.0mg，置100ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為西羅莫司的儲(chǔ)備液(100mg/L)，置-20冰箱保存，使用當(dāng)天將儲(chǔ)備液用乙腈稀釋至所需濃度。    

10、內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取FK506對(duì)照品10.0mg，置500ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(20mg/L)，置4冰箱保存。使用當(dāng)天將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋至所需濃度(1.0mg/L)。    緩沖液 將4.11g乙酸鈉固體溶于100ml去離子水中，用乙酸調(diào)pH值至4.6，定容至500ml。        1.2 方法    (1) 樣品處理方法 取抗凝全血樣品1.0ml，置15ml塑料試管中，準(zhǔn)確加入20l內(nèi)標(biāo)溶液(20

11、ng)，再加入乙酸鹽緩沖液(pH4.6)1ml，叔丁基甲醚5ml，混旋30min后，離心(3000r/min)10min，取上清，氮?dú)獯蹈?。?1的乙腈水溶液100l溶解進(jìn)樣。    (2)色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C8(50mm×2.1mm，1.7m)；流動(dòng)相：水(含0.5%甲酸)乙腈(4060)；流速0.5ml/min；進(jìn)樣量10l；三重四極桿質(zhì)譜采用正離子模式，離子源溫度設(shè)為105，離子源電離電壓為3300V，霧化氣流速為500L/h。離子采集方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，采集離子(母離子/子離子)

12、西羅莫司為931.2/864.1，F(xiàn)K506為822.0/577.0。    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果    2.1 方法專屬性考察    取空白全血1.0ml，按“全血樣品處理”步驟操作，進(jìn)樣10l，得提取離子色譜圖(Fig.1)，將一定濃度的西羅莫司對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白全血，同法操作，得提取離子色譜圖；取一個(gè)用藥的全血，加入內(nèi)標(biāo)，同法操作，得提取離子色譜圖。結(jié)果表明，全血中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)西羅莫司和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定都不干擾。    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲

13、線及檢測(cè)限    取不同體積西羅莫司對(duì)照品溶液加入到1.0ml全血中，配制成一系列濃度的全血樣品，濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0和240.0g/L，加入內(nèi)標(biāo)后按“全血樣品處理”項(xiàng)提取后進(jìn)樣測(cè)定；以濃度(C，g/L)為縱坐標(biāo)，西羅莫司與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(A)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，血藥濃度在1240g/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.2g/L?；貧w方程為：    C=24.888A-0.4376 r=0.9995    

14、;2.3 精密度考察實(shí)驗(yàn)    取空白全血1.0ml，配制低、中、高三個(gè)濃度(2、16、128g/L)的溶液，加入內(nèi)標(biāo)后按“全血樣品處理”項(xiàng)提取后進(jìn)樣測(cè)定(n=5)。連續(xù)測(cè)定5d，分別求得日內(nèi)、日間精密度，RSD%均在15%以內(nèi)，滿足生物樣品分析要求，結(jié)果見Tab.1。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。    2.4 提取回收率和方法回收率考察 

15、60;  取空白全血1.0ml，配制低、中、高三個(gè)濃度(2、16、128g/L)的溶液，加入內(nèi)標(biāo)后按“全血樣品處理”項(xiàng)提取后進(jìn)樣測(cè)定，記錄西羅莫司的峰面積A；分別用11的乙腈水配置上述3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，同樣條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄西羅莫司峰面積Asd，全血中西羅莫司提取回收率=A/Asd×100%。分別配置3個(gè)濃度的全血樣品進(jìn)行提取測(cè)定，方法回收率用測(cè)定濃度與配置濃度的比值(%)表示，結(jié)果見Tab.1。全血中西羅莫司的提取回收率在75%以上，方法回收率在95.0%98.5%之間。    2.5 穩(wěn)定性考察 

16、0;  取-20保存的低、中、高(2、16、128g/L)三種濃度全血樣品，放置室溫，反復(fù)凍融三次，加入內(nèi)標(biāo)后按“全血樣品處理”項(xiàng)提取后進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與理論值比較，誤差在±15%以內(nèi)。樣品提取后的穩(wěn)定性也進(jìn)行了考察，低、中、高三種濃度(2、16、128g/L)全血樣品處理完后，與室溫放置0、3、6和9h后測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與理論值比較，誤差在±15%以內(nèi)。符合生物樣品分析要求。    3 討論與結(jié)論    他克莫司(FK506)的色譜行為與西羅莫司很相近，故選作內(nèi)標(biāo)。其二級(jí)質(zhì)

17、譜離子(822.0/577.0)靈敏度高且穩(wěn)定；在血液中西羅莫司大部分與紅細(xì)胞結(jié)合，其余部分與血漿脂蛋白結(jié)合4，所以測(cè)定血藥濃度需用全血。由于測(cè)定全血時(shí)干擾物質(zhì)較多，國(guó)外文獻(xiàn)曾采用反相C18固相萃取柱處理樣品1，操作費(fèi)時(shí)且重現(xiàn)性差。本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取處理樣品，超高效液相色譜分離，去除了全血中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，方法簡(jiǎn)便省時(shí)，克服了采用固相萃取的缺點(diǎn)。另外，由于該藥劑量小，血藥濃度低、治療范圍窄及檢測(cè)穩(wěn)定態(tài)谷濃度的要求，檢測(cè)方法必須靈敏準(zhǔn)確，現(xiàn)有分離方法均為HPLC分離；采用超高效液相色譜技術(shù)，大大提高了分離效能，改善了分離度，縮短了保留時(shí)間，使色譜峰變得更窄、更高，質(zhì)譜為濃度型檢測(cè)器，當(dāng)色譜峰變

18、窄時(shí)，信噪比會(huì)更高，靈敏度可以提高數(shù)倍。    我們所建立的UPLC/MS/MS新方法，利用了超高效液相色譜的柱效高、靈敏度高，省時(shí)以及MS/MS檢測(cè)器的特異選擇性等優(yōu)點(diǎn)，使該方法具有樣品處理簡(jiǎn)單，方法靈敏、快速、選擇性強(qiáng)，滿足了西羅莫司體內(nèi)藥物監(jiān)測(cè)的要求。本方法不足之處是新型儀器UPLC/MS/MS價(jià)格偏高。【參考文獻(xiàn)】1 David W H, Terry L, Kirsty J, et al. Validation of an assay for routine monitoring of sirolimus using HPLC with mass spectrometric detection J. Clin Chem,2000,46(8):11792 Cattaneo D, Perico N, Gaspari F. Assessment of sirolimus concentrations in whole blood by high performance liquid chromatrography with ultraviolet d