伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎氧化應(yīng)激、ＮＦ-Ｂ活性和ＩＣＡＭ-１

1、伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎氧化應(yīng)激、-活性和- 表達(dá)的影響        【摘要】     【目的】 探討伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激、-活性和- 表達(dá)水平的影響。 【方法】 將 只大鼠隨機(jī)分為 組：正常對(duì)照組（）、糖尿病組（）和伊貝沙坦組（）。糖尿病大鼠模型用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)。大鼠飼養(yǎng)周后，觀察尿微量白蛋白排泄率（），取出腎臟作腎組織病理檢查，測(cè)定腎組織中丙二醛（）含量與超氧化物歧化酶（）、過(guò)氧化氫酶（）、谷胱苷肽過(guò)氧化物酶（-）活性變化。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（-）

2、法檢測(cè)腎組織中細(xì)胞間粘附因子-（-）的表達(dá)。凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析（）檢測(cè)核因子（）-的活性。 【結(jié)果】 在組（ ± ）及組（ ± ）均顯著高于組（ ± ）， ；組較組顯著降低， 。與組大鼠比較，組大鼠腎組織含量顯著增高（ ± ± ）， ；、及-活性均顯著降低（ ± ， ± ， ± ± ， ± ，±）， ；組腎組織含量（ ±）明顯低于組， ；、及-活性（ ± ， ± ， ± ）明顯高于組，均 。-活性在組大鼠腎組織（ ± ）明顯高于組（

3、 ± ）， ；組（±）明顯低于組， 。組腎組織- 表達(dá)（ ± ）明顯高于組（±）， ；組腎組織- （±）表達(dá)明顯低于組， ?！窘Y(jié)論】 伊貝沙坦可能部分通過(guò)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)以及下調(diào)糖尿病大鼠腎組織中-的活性，降低- 的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。     【關(guān)鍵詞】  糖尿病腎病； 伊貝沙坦； 氧化應(yīng)激； 核因子（）-； 細(xì)胞間粘附因子-     ， - ， - -， ， -， -， -， -， -（ ， ， - ， ， ）： 【】 ， - -

4、【】 - （） ： ： ； ： ； ： ， （） （） （）， （）， （-）， - （-） - - - （-） （） 【】 （ ± ） （ ± ） （ ± ）（ ）   （ ） ， （ ± ± ， ）； ， ， - （ ± ， ± ， ± ± ， ± ， ± ， ） （ ± ） （ ） ， ， - （ ± ， ± ， ± ， ） - （ ± ） 糖尿病腎?。?， ）是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和威脅患

5、者的生命，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在鏈脲佐菌素（，）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，血管緊張素系統(tǒng)和氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎臟病變的發(fā)病機(jī)制，糖尿病時(shí)高血糖使腎組織內(nèi)血管緊張素（）增加，導(dǎo)致腎血管通透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；高血糖還可使活性氧（ ，）生成增加，損傷自身的抗氧化系統(tǒng)，參與的發(fā)生。是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，、及-是抗氧化的幾項(xiàng)主要指標(biāo)。研究認(rèn)為，能激活核因子（）-，繼而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄-等多種對(duì)腎組織有損傷的介質(zhì)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)受體拮抗劑伊貝沙坦可抑制的增加，但是有關(guān)伊貝沙坦對(duì)-通路影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用并探討其對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和-活性

6、、- 表達(dá)水平的影響。  材料與方法  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑雄性-（）大鼠只（廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），月齡，體質(zhì)量 ，在恒溫 、相對(duì)濕度 、晝夜周期 環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)周，自由覓食與飲水。（美國(guó)公司），（公司），（公司）， 聚合酶、 （上海生工），-基礎(chǔ)試劑盒、上樣緩沖液（公司），伊貝沙坦（法國(guó)賽諾菲公司），尿白蛋白試劑盒（法國(guó) 公司），丙二醛（）、超氧化物歧化酶（）、過(guò)氧化氫酶（）以及谷胱苷肽過(guò)氧化物酶（-） 試劑盒（南京建成生物工程研究所），試劑盒（美國(guó)公司）。 糖尿病大鼠模型的建立及分組糖尿病大鼠模型的制作： 溶液，按 腹腔注射， 后經(jīng)尾靜脈采血測(cè)血糖（ 血糖儀：美國(guó)公司）

7、。成模標(biāo)準(zhǔn)： 后測(cè)血糖空腹血糖 ，對(duì)照組予以腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。糖尿病造模成功待血糖穩(wěn)定一周后，大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組，分為對(duì)照組（）、模型組（）、伊貝沙坦組（）。每組只。用藥方案：均為強(qiáng)制性灌胃，伊貝沙坦組大鼠給予伊貝沙坦 （·）劑量，對(duì)照組與糖尿病組給予等量蒸餾水灌胃。所有大鼠在周實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由覓水，不應(yīng)用胰島素。  標(biāo)本收集周末將全部大鼠置代謝籠收集 尿液保存，測(cè)尿白蛋白。所有大鼠禁食 后稱(chēng)量體質(zhì)量，用戊巴比妥溶液 腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血標(biāo)本測(cè)血糖水平；處死大鼠，迅速灌洗后腎臟游離，取 大小腎組織，外固定，行染色。剩余腎組織速置于液氮中保

8、存，凍透后轉(zhuǎn)入 冰箱中待測(cè)腎組織含量與、-活性變化，及測(cè)- 表達(dá)及-活性。  尿微量白蛋白排泄率（）測(cè)定 尿白蛋白水平（） × 尿量（），尿白蛋白測(cè)定采用放射免疫法。  腎組織含量與、-活性的測(cè)定用硫代巴比妥酸（）法，活性用黃嘌呤氧化酶法，活性用化學(xué)比色法，-活性用二硫代二硝基苯甲酸法。  腎組織病理形態(tài)檢查采用-型圖像分析系統(tǒng)對(duì)病理切片進(jìn)行分析，在倍視野下隨機(jī)選擇皮質(zhì)區(qū)個(gè)腎小球截面，檢測(cè)腎小球截面平均直徑（），根據(jù)體視學(xué)公式 計(jì)算出平均腎小球直徑（），再根據(jù)公式（）計(jì)算出平均腎小球體積（ ，）。  -活性檢測(cè)按照方法提取腎組織核蛋白： 取 腎

9、組織，加入溶液（） - 羥乙基哌嗪-乙烷磺酸（， ）、 ， ， 乙二胺四乙酸二鈉（）， 二硫蘇糖醇（）， 苯甲基磺酰氟（），美國(guó)公司，用研磨器研磨至勻漿狀，冰浴，以離心半徑 、 離心 ，棄上清，溶液洗滌，以離心半徑 、 離心 ，棄上清。下層沉淀加入 預(yù)冷的溶液（）  （）、 、 、 、 、 ，甘油，冰上孵育 ，以離心半徑 、 離心 ，取上清，即為核蛋白提取物。取少量用法測(cè)定提取物中蛋白濃度，剩余部分置于液氮中凍透后移至 冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｄz電泳遷移率變動(dòng)分析（）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：將核蛋白提取液加入凝膠遷移結(jié)合緩沖液 -（ ）、 甘油、 、 、 、 ， 非特異性競(jìng)爭(zhēng)（-）中預(yù)孵育

10、，加入- 標(biāo)記的-一致性雙鏈寡核苷酸探針，室溫孵育 ，反應(yīng)體系 。-一致性雙鏈寡核苷酸序列： 。將形成的核蛋白復(fù)合物在 非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行垂直電泳放射自顯影 。用凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。  - 檢測(cè)試劑提取腎皮質(zhì)總，取總產(chǎn)物進(jìn)行-擴(kuò)增反應(yīng)。-引物序列：上游為-；下游為：-。內(nèi)參照-引物序列：上游為- -，下游為- - 。反應(yīng)條件： 預(yù)變性， 變性， 退火， 延伸，共循環(huán)。所有循環(huán)最后均 延伸 。產(chǎn)物在 瓊脂糖凝膠（染色）上電泳檢測(cè)，以為分子大小標(biāo)記，在紫外燈下觀察并照相，在圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行密度掃描。以-基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度比較，表示-的表達(dá)水平。  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量

11、數(shù)據(jù)以±表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間差異性比較用檢驗(yàn)及單因素方差分析， 表示差異有顯著性意義。   結(jié)果  各組一般情況實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，無(wú)死亡；糖尿病造模成功后大鼠均出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦及生長(zhǎng)行動(dòng)遲緩等癥狀。其中，組有只死亡，組有只死亡，其中組只死于灌胃誤傷，余死因不詳。組及組血糖均明顯高于組、體質(zhì)量均低于組；組與組間血糖、體質(zhì)量異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組及組均顯著高于組；組較組顯著降低（表）。   各組腎組織病理形態(tài)改變與組相比，組大鼠腎小球截面積、平均腎小球體積明顯增大，組平均腎小球體積較組明顯降低（圖）。&#

12、160; 各組腎組織含量與、-活性組腎組織含量明顯高于組，、及-活性明顯低于組；組腎組織含量明顯低于組，、及-活性明顯高于組（表）。  各組腎組織-活性的改變組腎組織-活性明顯高于組；組明顯低于組（表）。半定量-結(jié)果顯示，在 處可見(jiàn)清晰的-擴(kuò)增條帶，在 處可見(jiàn)內(nèi)參照-的條帶。組腎組織- 表達(dá)明顯高于組；組腎組織- 表達(dá)明顯低于組（圖，表）。   討論腹腔注射制備大鼠糖尿病動(dòng)物模型的方法已被廣泛采用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外基本認(rèn)定糖尿病大鼠血糖值 作為糖尿病大鼠的成模標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中，用 按 腹腔注射， 后，出現(xiàn)多飲、多尿、多食等癥狀，測(cè)空腹血糖 ，病程中血糖始終在建模時(shí)的高

13、水平波動(dòng)，未見(jiàn)轉(zhuǎn)復(fù)，表明本實(shí)驗(yàn)中大鼠模型成立。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠比較，糖尿病組大鼠出現(xiàn)明顯的腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，平均腎小球體積增加，系膜基質(zhì)增生明顯，腎小球系膜區(qū)、基底膜區(qū)明顯深染擴(kuò)大；伴隨尿微量白蛋白升高；伊貝沙坦治療周后，腎組織形態(tài)學(xué)損害明顯改善，包括腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯減少、平均腎小球體積增加程度減輕，毛細(xì)血管腔開(kāi)放、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善、腎小球基底膜增厚及系膜細(xì)胞增生明顯減輕，同時(shí)增加的尿蛋白減少減輕，而血糖并無(wú)明顯改變。表明伊貝沙坦能夠阻止或延緩糖尿病大鼠腎臟的病理?yè)p害。糖尿病時(shí)腎組織中自由基代謝異常，高血糖及其代謝產(chǎn)物本身都是氧化劑，它們都消耗自由基清除劑；與葡萄糖接觸時(shí)，

14、抗氧化酶本身的糖基化也會(huì)降低其生物活性，導(dǎo)致體內(nèi)自由基大大增加，同時(shí)機(jī)體抗氧化防御能力下降，腎臟局部氧自由基的產(chǎn)生及清除失衡而使腎組織中增多，可直接引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性， 最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡、組織損傷和疾病發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病各組大鼠腎組織中含量高于正常組，、-活性均低于于正常組。經(jīng)過(guò)治療后，伊貝沙坦治療組腎組織中含量低于糖尿病組，但仍高于正常組；伊貝沙坦治療組腎組織中、-活性高于糖尿病組，但仍低于正常組。本研究結(jié)果提示氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，而且伊貝沙坦對(duì)腎臟的保護(hù)作用與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。糖尿病狀態(tài)下腎素-血管緊張素系統(tǒng)（）活性增高，尤其是腎組

15、織中含量增加，可促進(jìn)的合成， 可通過(guò)激活絲裂原激活蛋白激酶（）信號(hào)傳導(dǎo)通路，使核因子抑制蛋白（）磷酸化而被降解，使與-分離，激活-。-是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫、炎癥等多種基因調(diào)控。近年來(lái)大量的研究表明，糖尿病患者處于炎癥狀態(tài)，血清- 活性升高。-與的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。等發(fā)現(xiàn)： 患者-表現(xiàn)出更高的結(jié)合活性，且其活性與蛋白尿程度相關(guān)，這說(shuō)明-活性與及其程度密切相關(guān)。細(xì)胞間粘附分子-（ -，-）則是-調(diào)控的一個(gè)下游靶基因，可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞黏附而參與的病理生理過(guò)程。等用-特異性抗體及間接免疫熒光法分析了鏈脲佐菌素（）誘導(dǎo)鼠-的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鼠腎小球

16、- 表達(dá)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織中-的活性和- 的表達(dá)顯著增強(qiáng)，伊貝沙坦干預(yù)組腎組織中-的活性和- 的表達(dá)明顯低于未干預(yù)組。證明了糖尿病時(shí)腎組織內(nèi)存在-的激活，進(jìn)而導(dǎo)致-表達(dá)增加，這可能是的發(fā)病機(jī)制之一。而伊貝沙坦改善至少部分是通過(guò)抑制-通路降低-表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管緊張素-型受體拮抗劑伊貝沙坦能減輕糖尿病大鼠腎臟損害的進(jìn)展， 其機(jī)制可能與伊貝沙坦抑制糖尿病大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制-的活化，降低-表達(dá)有關(guān)。伊貝沙坦既能緩解血流動(dòng)力學(xué)異常，又能緩解糖尿病腎組織內(nèi)的炎癥過(guò)程，為的研究提供了另一途徑。    【參考文獻(xiàn)】  1 ， （），（）：-2 ， ， ， - ，（）：-3 ， ， ， - （ ） ， ，（）：- 4， ， ， - ，（）：-5施新猷 醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué) 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，：6馬洪波， 張木勛， 路 群，等 糖尿病大鼠腎組織中-調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白-表達(dá)作用的研究中華糖