淋巴細胞分離

1、淋巴細胞的分離技術與培淋巴細胞的分離技術與培養(yǎng)養(yǎng)細胞分離原理與手段 基于對細胞物理特性 1 細胞比重差異（自然沉降法、密度梯度離心法、改變細胞密度法） 2 細胞的粘附性（貼壁細胞對玻璃、塑料器皿的粘附，B細胞對尼龍棉的粘附） 3 細胞對滲透壓改變的敏感性（紅細胞對低滲敏感，低滲處理，能使其裂解） 基于細胞表面的特異性標志物 1 補體細胞毒分離法 2 免疫磁珠分離法 3 流式細胞術血液細胞的組成及比重外周血紅細胞紅細胞粒細胞單個核細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.0301.0351.0751.090(PBMC)1.092單個核細胞的特點 單核細胞：貼壁生長，能吞噬羥基鐵粉 淋巴細

2、胞：懸浮生長 1 粘附力：B細胞尼龍棉 2 細胞表面標志物 T細胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等 NK細胞：CD2、CD8、CD16、CD56等 淋巴細胞分離的流程密度梯度密度梯度離心法離心法粘附去除粘附去除改變細胞密改變細胞密度法度法E E花環(huán)分離法花環(huán)分離法尼龍棉分離法尼龍棉分離法流式細胞術流式細胞術磁珠分離法磁珠分離法單個核細胞的分離單個核細胞的分離 密度梯度離心密度梯度離心法法 原理： 外周血各種血細胞的比重不同，利用淋巴細胞分層液作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。 為此利用一種密度介于1.0751.092之間而近于等滲的溶液

3、（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。 常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。密度梯度離心法 FicollFicoll：1.0771.0770.0010.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090細胞細胞比重比重血小板血小板1.0301.0351.0301.035單個核細胞單個核細胞1.0751.0901.0751.090粒細胞粒細胞1.0921.092紅細胞紅細胞1.0931.093細胞比重細胞比重分層液比重分層液比重離心后離

4、心后PBMC紅細胞粒細胞Ficoll/60% Percoll稀釋外周血稀釋的血漿的血漿、血小板、血小板Ficoll/60% Percoll實驗步驟 1.采血，稀釋 （外周血：稀釋液=1：2）2.在離心管中加入分層液，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血 （Ficoll：稀釋血=1：2）3. 20，1500r/min，離心30min4. 沿管壁周緣輕輕吸取PBMC層移入另一試管中5.加足量稀釋液充分洗滌，1800 r/min離心10min ，棄上清6.重復洗滌一次，1400r/min離心10min，棄上清7.適量的培養(yǎng)基重懸細胞 ，計數(shù)8.細胞活性檢測淋巴細胞分離淋巴細胞分離 吸附法和改變細胞密度吸

5、附法和改變細胞密度法法單核細胞：貼壁生長，能吞噬羥基鐵粉淋巴細胞不具有這些特點粘附去除法原理：單核細胞和粒細胞在37和Ca離子存在條件下能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠。采集的非粘附細胞即為淋巴細胞。方法：1、玻璃器皿吸附法 2 玻璃纖維柱法優(yōu)點：簡便易行，對細胞損傷極少。缺點：B細胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細胞丟失。 該法去除單核細胞后，大約95%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。改變細胞密度法原理：單核細胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細胞密度增大。方法一：磁鐵吸引法方法二：羥基鐵-乳膠分層液法 T、B、NK細胞的分離細胞的分離T細胞能與細胞

6、能與STBC結合形成結合形成E花環(huán)花環(huán)E花環(huán)分離花環(huán)分離T細胞細胞B細胞對尼龍纖維特有的吸附能力細胞對尼龍纖維特有的吸附能力尼龍纖維分離尼龍纖維分離B細胞細胞淋巴細胞表面的標志差異淋巴細胞表面的標志差異免疫磁珠分離法與流式免疫磁珠分離法與流式細胞術細胞術E花環(huán)分離法原理： 人類T細胞表面上有能與綿羊紅細胞相結合的受體（E受體，CD2）,能與經2-氨乙基異硫溴化物（AET）處理的綿羊紅細胞結合，形成穩(wěn)定的、細胞體積和比重較大的E花環(huán)。實驗步驟1 AET-E花環(huán)實驗：將分離的單個核細胞（20萬/ml)與等量的1%AET-SRBC混合，37水浴15min,每5min搖勻一次，然后分裝，每管23ml，

7、低速離心（1000r/min)5min后，4冰箱45分鐘。2 T、B細胞分離： 淋巴細胞+SRBC懸液加入分層液T細胞形成E花環(huán)而沉于管底懸液中為B細胞。3 T細胞分離：取沉淀于管底的E花環(huán)，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3ml處理3s，低滲裂解E-花環(huán)周圍SRBC，立即加3.5%NaCl溶液1ml，使還原為等滲，低速離心沉淀，即的富含T淋巴細胞群。試劑配制 AET溶液：稱取AET粉劑402mg,溶于10ml去離子水中，用4mol/L NaOH溶液約910滴，調至pH9.0，用0.2m濾膜過濾除菌。用前臨時配制。 AET-SRBC的制備： 1 SRBC中加等滲鹽溶液（1:4）， 1800r/

8、min離心5min，連續(xù)洗滌5次 2 取壓積的SRBC，加入新鮮配制的pH9.0的AET溶液（1:4），置37水浴15min，每隔5min搖勻一次。 3 加入預冷無菌等滲鹽溶液，1800r/min離心5min，連續(xù)洗滌5次， 4 用含小牛血清的RPMI-1640液配成10% AET-SRBC懸液，置4保存，不得超過5天。使用時用10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至1% ；原理： B細胞在37時易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細胞不具此能力。方法： 淋巴細胞通過聚酰胺纖維管洗脫下來的是T細胞。尼龍纖維分離法磁珠分離法 原理：1 磁性微珠，可結合不同的生物大分子物質（抗原、抗體、核酸

9、等）；2 在液相中，受外加磁場的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。 以磁性微珠為載體，包被上針對某種細胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。 基本步驟：首先將抗特異細胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細胞反應后，利用磁力的作用，使與致敏結合的細胞與其它物質分離，達到純化、分離的目的。 方式：陽性分離和陰性分離。陽性分離是直接從細胞混合液中分離出靶細胞，陰性分離是利用磁珠去除無關細胞，使靶細胞得以分離淋巴細胞的表面標志 CD抗原抗原 特特 異異 性性 CD2 E受體、全部T細胞和 部分NK細胞 CD3 成熟T細胞 CD4 Th細胞、M、HIV受體 CD8 Tc細胞、NK細胞的亞型

10、 CD25 IL-2受體、活化T細胞 CD16、CD56 NK細胞單克隆抗體單克隆抗體CD3羊抗鼠修羊抗鼠修飾磁球飾磁球Biomag抗抗CD3磁球磁球磁球結合磁球結合T細胞細胞加入加入B和和T細胞中細胞中負向選擇負向選擇正向選擇正向選擇磁架進行分離磁架進行分離直接法對細胞進行分類直接法對細胞進行分類間接法對間接法對T細胞進行分離細胞進行分離陽性分選陽性分選優(yōu)優(yōu)點：純度高，點：純度高，回收率高，回收率高，操作迅速、操作迅速、簡便。簡便。陰極分選陰極分選使用范圍：使用范圍：1 去除不需要的細胞去除不需要的細胞2 缺乏針對目的細胞缺乏針對目的細胞的特異性抗體的特異性抗體3不需要抗體和目的不需要抗體和

11、目的細胞結合細胞結合4復合分選的一部分復合分選的一部分 實用范圍：主要用于細胞亞群的分選或者得到高純度非常稀有的細胞。主要方式：1 去除后再陽性分選細胞亞群的分選，可以先磁性標記非目的細胞，去除分選后對陰性組分再行磁性標記和陽性分選。2 多重分選多次陽性分選根據(jù)多種表面標志磁性分選細胞復合分選 又叫熒光激活細胞分離法。原理： 細胞經熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細胞排成單行，逐個流經檢測區(qū)進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個/s)，每小滴內最多含一個細胞，細胞經激光束照射產生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經電腦處理

12、，分辨細胞的類型。流式細胞術激發(fā)系統(tǒng)激發(fā)系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)熒光激活細胞分離儀分離法熒光激活細胞分離儀分離法 檢測與訊號處理系統(tǒng)檢測與訊號處理系統(tǒng)細胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)細胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)操作方法 1. 將分離的單個核細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基配成1107 /ml； 2. 加適量熒光抗原（NK細胞特異性的抗原為CD16、CD56；T細胞CD3），4孵育30min，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次； 3. 用流式細胞儀進行分析。在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽性的細胞進行分選。總結 T細胞分離 1 E花環(huán)分離取沉淀，低滲裂解，洗滌 2

13、磁珠分離法或流式細胞術 B細胞分離 E 花環(huán)分離取上清，磁珠分離標記CD16或CD56 NK細胞分離 E花環(huán)取上清或尼龍纖維分離液，磁珠或流式細胞術分離 T細胞亞型分離T細胞分離的基礎上，磁珠分離法或流式細胞術淋巴細胞淋巴細胞的培養(yǎng)淋巴細胞的培養(yǎng)淋巴細胞的保存淋巴細胞的保存（1）短期保存：用含有1020%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI 1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周。（2）長期保存：在保護劑二甲基亞砜中于液氮（-196)中保存。其過程是：先對需凍存的細胞作活細胞計數(shù)，低速離心后，取沉積細胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當濃度的細胞懸液，分裝于凍存管內，4緩沖，-20結冰，轉

14、移 -80過夜，繼而進行降溫(-196)冷凍。（3）復蘇：將其從液氮中取出，立即放入40 溫水中，融化后加入10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計數(shù)并檢查細胞活力。淋巴細胞的培養(yǎng)淋巴細胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)條件： （1）無菌 （2）恒溫：培養(yǎng)箱的溫度應嚴格控制在370.5 （3）氣體環(huán)境：02和C02 。大多數(shù)細胞的適宜pH為7.27.4。 （4）培養(yǎng)液： RPMI1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)用無機鹽、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴細胞分離液、植物凝集素(PHA)和白細胞介素等。 操作步驟：1、洗滌 將收集到的淋巴細胞集中于離心管中用培養(yǎng)液洗滌兩次，分別以2500和2000

15、rpm離心各10min，棄上清，之后進行接種。2、細胞接種 細胞接種通常是在無菌室超凈工作臺內的酒精燈火焰區(qū)進行。3、搖床培養(yǎng) 將接種后的培養(yǎng)瓶放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37、5%CO2、飽和濕度。從72h開始每48h添加等體積的新鮮培養(yǎng)液。 細胞活力的測定細胞活力的測定臺盼藍染色法臺盼藍染色法原理原理 常用方法是臺盼藍染色法。這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，常用方法是臺盼藍染色法。這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞而使細故活細胞不著色，死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞而使細胞著色（藍色）胞著色（藍色）步

16、驟：步驟：1、制備單細胞懸液。并作適當稀釋、制備單細胞懸液。并作適當稀釋(106 細胞細胞/ml)2、染色：細胞懸液與、染色：細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以臺盼藍溶液以9:1混合混勻?；旌匣靹?。3、計數(shù)：在三分鐘內，用計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞結果統(tǒng)計：、計數(shù)：在三分鐘內，用計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞結果統(tǒng)計：鏡下觀察，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。鏡下觀察，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。根據(jù)下式求細胞活力：根據(jù)下式求細胞活力：活細胞率活細胞率(%)= 活細胞總數(shù)活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)死細胞總數(shù))100Thank youThank you FicollFic

17、oll：1.0771.0770.0010.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090細胞細胞比重比重血小板血小板1.0301.0351.0301.035單個核細胞單個核細胞1.0751.0901.0751.090粒細胞粒細胞1.0921.092紅細胞紅細胞1.0931.093細胞比重細胞比重分層液比重分層液比重粘附去除法原理：單核細胞和粒細胞在37和Ca離子存在條件下能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠。采集的非粘附細胞即為淋巴細胞。方法：1、玻璃器皿吸附法 2 玻璃纖維柱法優(yōu)點：簡便易行，對細胞損傷極少。缺點：B細胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細胞丟失。 該法去除單核細胞后，大約95%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。改變細胞密度法原理：單核細胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細胞密度增大。方法一：磁鐵吸引法方法二：羥基鐵-乳膠分層液法 T、B、NK細胞的分離細胞的分離T細胞能與細胞能與STBC結合形成結合形成E花環(huán)花環(huán)E花環(huán)分離花環(huán)分離T細胞細胞B細胞對尼龍纖維特有的吸附能力細胞對尼龍纖維特有的吸附能力尼龍纖維分離尼龍纖維分離B細胞細胞淋巴細胞表面的標志差異淋巴細胞表面的標志差異免疫磁珠分