細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究進(jìn)展

1、細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究進(jìn)展    【摘要】  細(xì)胞移植治療脊髓損傷是近年來脊髓損傷修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一。本文綜述了采用細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究現(xiàn)狀，并提出了筆者的一些見解。本文著重綜述了嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植應(yīng)用于脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，評價了三種細(xì)胞移植各自的優(yōu)缺點(diǎn)，期望為脊髓損傷及其修復(fù)的相關(guān)研究提供較全面的綜合參考資料。 【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞移植；脊髓損傷；嗅鞘細(xì)胞；雪旺細(xì)胞；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞     Abstract： Cell transplantation is a new h

2、ot focus in the field of spinal cord injury research.In this review,we summarized experimental results that researchers had been acquired on cell transplantation for spinal cord injury.In addition,several comments were made according to our view of points.In general,various cells were mentioned in t

3、his review.They are olfactory ensheating cells,Schwann cells and bone marrow stromal stem cells，which were applied to treat spinal cord injury.Their excellences and weaknesses were to provide comprehensive references to relevant researches.     Key words:cell transplant,spinal cord in

4、jury,olfactory ensheathing cells,Schwann cells,bone marrow stromal stem cells    美國電影<超人>的扮演者Reeve在2004年10月份永遠(yuǎn)離開了我們。他不幸在9年前的一場馬術(shù)比賽中，摔傷頸椎，導(dǎo)致高位截癱。從那時起，他積極地在美國推進(jìn)干細(xì)胞的研究，希望能通過干細(xì)胞移植讓更多由于脊髓損傷而導(dǎo)致癱瘓的病人重新站立起來。近年來，全世界的科學(xué)家都在積極地探索采用細(xì)胞移植治療脊髓損傷的新方法，這使利用細(xì)胞移植治療脊髓損傷取得了長足的進(jìn)步。本文綜述了嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等三種應(yīng)用

5、前景較好的種子細(xì)胞在細(xì)胞移植治療脊髓損傷中的研究現(xiàn)狀。     1  嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷     1.1  嗅鞘細(xì)胞的分布和生物學(xué)功能     嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells）直接起源于嗅基板，包裹嗅覺神經(jīng)束進(jìn)入嗅球，分布在嗅上皮、嗅神經(jīng)和嗅球的第一、二層。OECs是一種具有星形膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺（Schwann）細(xì)胞雙重特性的成鞘細(xì)胞，其生物學(xué)功能極為廣泛。     在體內(nèi)，嗅鞘細(xì)胞具有引導(dǎo)嗅覺系統(tǒng)軸突延長、控制突觸的

6、特定靶向的作用1。這與嗅鞘細(xì)胞的促生長作用密切相關(guān)。嗅鞘細(xì)胞膜上表達(dá)各種與細(xì)胞黏合和軸突生長相關(guān)的分子，如FNL、tenacisn、laminin及NCM2,3等。此外，嗅鞘細(xì)胞還能分泌多種促神經(jīng)元發(fā)育、生長、分化、存活的營養(yǎng)因子，如NGF、NT及BDNF等2-9。     1.2  嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷的優(yōu)越性     OECs移植到受損脊髓組織后，能引導(dǎo)損傷神經(jīng)軸突再生和發(fā)生髓鞘化作用，還能促進(jìn)神經(jīng)軸突穿越脊髓損傷后所形成的膠質(zhì)瘢痕區(qū)。1997年，Li等在 Science雜志上發(fā)表了“嗅鞘細(xì)胞移植誘導(dǎo)成年大鼠皮質(zhì)脊髓

7、束再生”的研究報告。這是嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷的最早報道。此后，許多學(xué)者進(jìn)行了這方面的研究并取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。     RamonCueto等1采用脊髓完全橫斷的方法造成急性脊髓損傷的動物模型，在損傷節(jié)段兩端分別注入OECs，術(shù)后37個月觀察到，動物的運(yùn)動功能和感覺反射都有所恢復(fù)。動物后肢有自主性運(yùn)動，能支撐身體重量，后肢輕觸覺和本體感覺有恢復(fù)。2002年，Li等10報道，通過切斷大鼠的單側(cè)上位頸髓造成脊髓損傷，術(shù)后立即將培養(yǎng)的OECs懸液移植到損傷脊髓部位。移植后27周連續(xù)觀察動物的運(yùn)動功能，發(fā)現(xiàn)大鼠前后肢的爬行功能明顯恢復(fù)。移植后2個月，用電生理方法檢測

8、膈神經(jīng)的動作電位變化，發(fā)現(xiàn)電位節(jié)律是中樞源的。他們的研究表明，OECs移植到受損脊髓后，可以同時恢復(fù)前后肢的爬行功能和呼吸功能。Verdu等11在大鼠的第8胸髓水平行椎板切除，下位脊髓用玫瑰紅浸泡，并用鹵素?zé)粽丈洌斐杉顾钃p傷模型，然后移植OECs。采用脊髓運(yùn)動功能評分(BBB評分)比較，發(fā)現(xiàn)OECs移植組大鼠的運(yùn)動功能、軀體感覺比對照組強(qiáng)?？笹FAP的免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，OECs移植組大鼠受保護(hù)的脊髓體積明顯大于對照組。KeyvanFouladi等12切斷大鼠的單側(cè)第1頸髓，術(shù)后8周植入OECs，移植后 13周內(nèi)，移植物連接到損傷部位并逐漸恢復(fù)前爪的取物功能。再生的皮質(zhì)脊髓束向尾端延伸10

9、 mm，在灰質(zhì)中形成樹枝狀末端。     OECs不但能直接參與神經(jīng)軸突髓鞘的形成，而且還具有分泌促進(jìn)神經(jīng)生長的因子及抑制有害因子的作用，從而改善脊髓損傷部位的內(nèi)環(huán)境，誘導(dǎo)損傷的脊髓神經(jīng)元再生，達(dá)到脊髓再生和功能恢復(fù)的目的。一方面，OECs能改變脊髓損傷局部的抑制性內(nèi)環(huán)境。在體外培養(yǎng)和體內(nèi)研究OECs中發(fā)現(xiàn)，能分泌大量不同種類的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)素4（NT-4），以及血小板衍化生長因子（PDGF）、神經(jīng)肽Y，S-10013等，這些物質(zhì)是神經(jīng)元生長、發(fā)育、分化、成熟的必需因子。

10、且OECs細(xì)胞膜上具有參與細(xì)胞黏附和軸突生長的蛋白分子，如Ll樣細(xì)胞黏附分子(CAML1)、層黏連素(1aminin)、含唾液酸的分子(PSANCAM)和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(N- CAM)14。另一方面，OECs能促進(jìn)受損神經(jīng)元軸突的再生、形成髓鞘和穿越膠質(zhì)瘢痕區(qū)。PerezBouza等15通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，OECs 具有很強(qiáng)的控制軸突再生方向的能力，OECs形成的“神經(jīng)膠質(zhì)橋”可穿過瘢痕等阻礙，沿著軸突縱軸方向延伸生長。     因此，OECs被認(rèn)為是治療脊髓損傷最有潛力的移植細(xì)胞之一。     2  雪旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷

11、    2.1  雪旺細(xì)胞的分布和生物學(xué)功能     雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包繞神經(jīng)纖維軸突形成髓鞘和神經(jīng)膜?，F(xiàn)已證明周圍神經(jīng)的再生能力主要?dú)w因于雪旺細(xì)胞。     雪旺細(xì)胞具有多方面的生理功能，在神經(jīng)纖維的再生修復(fù)中具有誘導(dǎo)、營養(yǎng)以及促進(jìn)軸突生長和成熟的作用。首先，雪旺細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)、睫狀

12、神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等16；產(chǎn)生促突起生長因子(neuritepromoting factor，NPF)，包括細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和細(xì)胞黏附分子(cellular adhesion molecules，CAM)17；釋放軸突誘導(dǎo)因子。這些物質(zhì)具有營養(yǎng)和保護(hù)受損神經(jīng)元、促進(jìn)軸突再生和出芽等作用。其次，雪旺細(xì)胞可以作為再生軸突的機(jī)械性導(dǎo)管樣引導(dǎo)物，支持和引導(dǎo)軸突再生。再次，雪旺細(xì)胞可以抑制膠質(zhì)瘢痕形成，改善損傷脊髓局部

13、微環(huán)境，從而減少脊髓再生障礙。     2.2  雪旺細(xì)胞治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究     許多實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)培養(yǎng)純化的雪旺細(xì)胞，無論在體內(nèi)或體外均能支持和促進(jìn)脊髓神經(jīng)突起的生長。David等18將含有雪旺細(xì)胞和基質(zhì)膠 (matrigel)的導(dǎo)管植入T8處橫切的大鼠脊髓內(nèi)，證實(shí)雪旺細(xì)胞移植組的再生軸突對電刺激會產(chǎn)生反應(yīng)，而Matrigel移植組的大鼠則無同樣的反應(yīng)性。Takami等19采用NYU法制作Fischer大鼠T9脊髓損傷模型，分別將嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞以及二者混合移植入損傷部位，l2周后行脊髓病理切片、免疫組化染色，結(jié)果

14、發(fā)現(xiàn)3組脊髓空洞體積均較空白對照組明顯減小，細(xì)胞向損傷部位兩端擴(kuò)散遠(yuǎn)達(dá)5 mm以上者分別占總數(shù)的43、51、44；單純雪旺細(xì)胞移植組軸突再髓鞘化程度明顯高于其他3組，大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)也最好。從而認(rèn)為雪旺細(xì)胞移植在脊髓損傷修復(fù)中的作用不可替代20。     目前，雪旺細(xì)胞作為移植細(xì)胞治療脊髓損傷的最大局限性是植入細(xì)胞的存活期較短和遷移距離有限。這是將雪旺細(xì)胞移植應(yīng)用于脊髓損傷臨床治療的急需解決的問題。另一方面，雪旺細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，基因修飾后在體內(nèi)具有良好的生長性且免疫原性小，所以雪旺細(xì)胞作為外源基因的載體應(yīng)用于脊髓損傷的基因治療具有巨大的前景，是

15、今后研究的一大熱點(diǎn)方向。     3  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷     骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)是來源于骨髓支持結(jié)構(gòu)的一種具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，又稱為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。這種細(xì)胞除具備干細(xì)胞的基本特點(diǎn)外，還具有細(xì)胞的可塑性或“克隆性”，表現(xiàn)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在特定信號的誘導(dǎo)下，依靠某類組織，并分化成該組織細(xì)胞，其細(xì)胞分化類型受其所處的組織微環(huán)境的影響21,22。在體內(nèi)和體外，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。脊髓損傷局部的微環(huán)境增加了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

16、向神經(jīng)元方向的誘導(dǎo)分化作用。    根據(jù)BMSCs的這種特性，Keating23等認(rèn)為BMSCs可作為自體體內(nèi)移植進(jìn)行基因治療的載體，并且已在進(jìn)行期臨床試驗(yàn)。最近研究顯示移植入脊髓半切的大鼠脊髓內(nèi)的人BMSCs無需進(jìn)行免疫抑制即可存活數(shù)月而沒有炎癥或免疫排斥反應(yīng)的跡象，而且可見軸突在移植物中生長24。這些特性使BMSCs成為脊髓損傷臨床基因治療的備選載體細(xì)胞之一。步星耀25等將BMSCs脊髓內(nèi)移植定向誘導(dǎo)分化與BMSCs定向分化誘導(dǎo)椎管內(nèi)移植相結(jié)合，移植途徑有直接受損脊髓多靶點(diǎn)注射；腰穿椎管內(nèi)植入，將擴(kuò)增的BMSCs移植于蛛網(wǎng)膜下腔，使之隨腦脊液到達(dá)病變

17、部位；靜脈移植，開放血腦屏障，將擴(kuò)增的BMSCs靜脈輸入，使之通過血腦屏障到達(dá)病變部位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后動物的運(yùn)動和感覺功能均有不同程度恢復(fù)。     骨髓基質(zhì)干細(xì)胞取材方便，可自體移植以避免免疫排斥反應(yīng)，又能進(jìn)行基因修飾，是脊髓損傷基因治療的良好載體細(xì)胞。目前，由于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)技術(shù)尚未成熟，單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷還有待進(jìn)一步研究。     4  存在的問題     多種來源和種類的細(xì)胞移植治療脊髓損傷已經(jīng)在小鼠、大鼠模型移植實(shí)驗(yàn)中取得明顯療效1,10-24,26,

18、27。遺憾的是，還有一些問題阻礙了細(xì)胞移植向臨床推進(jìn)，這些問題集中在以下方面，第一，骨髓來源的干細(xì)胞，盡管能向神經(jīng)細(xì)胞分化，但幾乎沒有實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明這些具有神經(jīng)細(xì)胞抗原標(biāo)記的跨胚層分化細(xì)胞，的確是有特定功能的神經(jīng)細(xì)胞26，27；第二，以往所進(jìn)行的移植實(shí)驗(yàn)，甚至臨床實(shí)驗(yàn)，所觀察到的療效沒有提供令人信服的理論依據(jù)；第三，干細(xì)胞存在致瘤性是國際共識和研究焦點(diǎn)，北京大學(xué)干細(xì)胞中心則證實(shí)，成熟度相對高的神經(jīng)干細(xì)胞移植后同樣具有較高的致瘤性；還有研究表明，胚胎干細(xì)胞分化出的細(xì)胞移植后，在發(fā)揮療效的同時，具有較強(qiáng)的致瘤性28。從理論上講，只要具有分裂增生能力的細(xì)胞被植入動物體，就具有形成腫瘤的可能。 

19、0;   在神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)研究29中，對各種神經(jīng)細(xì)胞的研究集中在細(xì)胞的分離、植入細(xì)胞的存活、分化的條件、調(diào)控因子以及移植后形態(tài)學(xué)改變等方面。在實(shí)驗(yàn)中，研究者實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞移植后部分存活并形成突觸或促進(jìn)突觸的形成，但是仍未解決移植后的神經(jīng)功能恢復(fù)。主要面臨以下問題，第一，形態(tài)和功能屬于不同的問題，突觸的建立并不等于神經(jīng)沖動能有效傳遞。神經(jīng)發(fā)育學(xué)表明，競爭的作用是保持功能的重要機(jī)制。事實(shí)上，在發(fā)育過程中有相當(dāng)一部分突觸會退化或處于休眠狀態(tài)（突觸精減），只有少數(shù)（甚至一個）突觸連接會發(fā)育并形成有效的活化突觸，從而保證功能的恢復(fù)；第二，突觸的連接是精確且有序的。特定的神經(jīng)元軸突只會向特

20、定的靶組織或特定的靶細(xì)胞生長并建立突觸連接，而且即使在最佳實(shí)驗(yàn)室條件下，每天的生長速度也不會超過1mm。也就是說，需要很長的時間，才有可能形成神經(jīng)元和靶細(xì)胞的連接；第三，神經(jīng)元即使與靶細(xì)胞連接成功，也必須經(jīng)過“易化”（facilitation）才能逐步產(chǎn)生功能性作用。因此，必須加大感覺信息的輸入，才有可能獲得運(yùn)動信號的輸出。而刺激在時間和空間上的積累是必不可少的?？梢?，要使成年動物或人產(chǎn)生一種新的“功能”，或恢復(fù)已經(jīng)喪失的功能，絕不僅是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞移植成活并建立形態(tài)上的突觸聯(lián)系就可以解決的?？傊?，在細(xì)胞移植后，應(yīng)當(dāng)考慮如何使再生的神經(jīng)元及其突觸真正產(chǎn)生功能作用，這才是實(shí)現(xiàn)脊髓損傷修復(fù)的本質(zhì)問題。

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