培養(yǎng)細(xì)胞的生存活性分析

1、培養(yǎng)細(xì)胞的生存活性分析 （一）培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)觀看 細(xì)胞在體外的生長過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的延續(xù)過程，細(xì)胞的數(shù)目、形態(tài)以及培養(yǎng)液的色彩、澄明度等在一定程度上都是細(xì)胞生長情況的表現(xiàn)。借助于肉眼或顯微鏡的協(xié)助，通過對(duì)上述常規(guī)指標(biāo)的觀看，可以有效地協(xié)助我們準(zhǔn)時(shí)掌握細(xì)胞的生長信息，適時(shí)、適當(dāng)實(shí)行相關(guān)措施培養(yǎng)好細(xì)胞。 1.的觀看 培養(yǎng)液的色彩和澄明度是肉眼觀看的兩個(gè)重要指標(biāo)。新奇的培養(yǎng)液普通展現(xiàn)桃紅色，ph約為7.2-7.4，培養(yǎng)過細(xì)胞后的培養(yǎng)液因?yàn)楹写罅考?xì)胞代謝產(chǎn)物而使得ph降低，色彩也逐漸變黃。培養(yǎng)液色彩的這種變幻是由其所含有的酚紅指示劑來顯示的，酚紅會(huì)隨溶液的ph變幻而轉(zhuǎn)變色彩，成為指示培養(yǎng)液ph的最直觀

2、指標(biāo)。培養(yǎng)液色彩變黃是細(xì)胞需要更換培養(yǎng)液的信號(hào)。普通狀況下，大多數(shù)細(xì)胞需要每2-3天換一次新奇培養(yǎng)液。需要注重的是，假如細(xì)胞在換液后或傳代后培養(yǎng)液很快就會(huì)變黃，這可能是細(xì)菌污染或培養(yǎng)瓶不整潔造成的。 正常狀況下，無論色彩如何變幻，培養(yǎng)液都能保持澄明。一旦發(fā)覺培養(yǎng)液變混濁，就應(yīng)注重是否有污染發(fā)生。上述狀況多適用于貼壁生長的細(xì)胞，對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞來說，隨著細(xì)胞密度的上升，培養(yǎng)液也會(huì)在一定程度上變渾，推斷其是否污染應(yīng)結(jié)合溶液色彩變黃的速度、增殖的速度、顯微鏡下是否可觀看到污染以及其他一些辦法舉行推斷。 2顯微鏡檢查 顯微鏡檢查簡(jiǎn)稱鏡檢，相差顯微鏡是利用光的衍射與干涉原理創(chuàng)造的，是觀看透亮活細(xì)胞的最

3、佳工具，可以清楚地協(xié)助我們看到生活狀態(tài)下細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并動(dòng)態(tài)觀看和記錄細(xì)胞的附著、貼壁、舒展、移動(dòng)、分裂等過程。 在不具備相差顯微鏡的試驗(yàn)室，一般的倒置顯微鏡也不失為一種好的觀看工具。生長情況良好的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀看時(shí)較為光明、折光性也強(qiáng)，細(xì)胞的輪廓不清但形態(tài)規(guī)章。生長情況不佳的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀看時(shí)折光性變?nèi)?、輪廓變得清楚，?xì)胞形態(tài)也變得不規(guī)章，細(xì)胞間的間隙變大，細(xì)胞中常浮現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)，狀況更嚴(yán)峻時(shí)，還可見到脫落死亡的細(xì)胞增多。 （二）細(xì)胞活力測(cè)定 1臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力 死細(xì)胞和受損細(xì)胞的細(xì)胞膜通常因缺損而不完整，這樣某些染料分子便可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部并使細(xì)胞被染上相應(yīng)

4、的色彩。與死細(xì)胞和受損細(xì)胞不同，活細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，能阻擋染料進(jìn)入細(xì)胞而拒染。臺(tái)盼藍(lán)便是這樣的染料，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色的死細(xì)胞或受損細(xì)胞常為淺藍(lán)色。除臺(tái)盼藍(lán)外，伊紅、苯胺黑也是常用的鑒定細(xì)胞活力的染料，所不同的是，經(jīng)伊紅和苯胺黑染色的死細(xì)胞或受損細(xì)胞分離為紅色和黑色。 2四甲基偶氮唑鹽（mtt）法測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)目和相對(duì)活力 四唑鹽比色試驗(yàn)是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞存活與生長情況的辦法，試驗(yàn)所用之顯色劑是一種能接受氫原子的染料，化學(xué)名為3-(4,5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四氮哩澳鹽，商品名是噻唑藍(lán)，簡(jiǎn)稱mtt。活細(xì)胞，特殊是增殖期的細(xì)胞可通過線粒體代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶的作用，使外源性淡黃色的

5、mtt被還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶物甲腹并沉積在細(xì)胞中，其形成量與活細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。利用dmso或酸化異丙醇進(jìn)一步溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物甲臜，在酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)下測(cè)定570nm波特長的光汲取值，可間接反映出活細(xì)胞數(shù)量的變幻狀況。 3的分裂指數(shù) 分裂指數(shù)是衡量體外培養(yǎng)細(xì)胞生長增殖情況的重要指標(biāo)，常用細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比來表示。分裂指數(shù)是測(cè)定細(xì)胞周期的一個(gè)重要指標(biāo)，與生長曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長久。同時(shí)，分裂指數(shù)也是不同試驗(yàn)討論挑選細(xì)胞的重要依據(jù)。 4集落形成試驗(yàn) 集落形成試驗(yàn)也稱克隆形成試驗(yàn)，是檢驗(yàn)細(xì)胞存活率和增殖能力的有效指標(biāo)。集落或克隆是指單個(gè)細(xì)

6、胞在體外經(jīng)6代以上增殖后所形成的細(xì)胞群體，直徑大小常在0.3-1.0mm。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)因?yàn)槌Ｐ韪街趫?jiān)硬的玻璃或塑料表面才干生長，而轉(zhuǎn)化或惡變的腫瘤細(xì)胞卻經(jīng)常喪失附著依靠生長的特性，可在軟瓊脂或甲基纖維素中以集落的方式生長。通過對(duì)集落的計(jì)數(shù)，不僅可以了解細(xì)胞的生存增殖能力，而且還可用于評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性、腫瘤發(fā)射生物學(xué)討論。 常用的集落形成試驗(yàn)主要有平板集落形成試驗(yàn)和集落形成試驗(yàn)，此處主要介紹軟瓊脂集落形成試驗(yàn)。 5細(xì)胞生長曲線的繪制 生長曲線是測(cè)定細(xì)胞生長基本邏輯的重要指標(biāo)，常通過每日或隔日延續(xù)計(jì)數(shù)細(xì)胞來繪制。廣泛用于比較和評(píng)價(jià)各種藥物、養(yǎng)分條件對(duì)細(xì)胞生長的影響。 6細(xì)胞周期的測(cè)定 細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)受的時(shí)光，即從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)受的時(shí)光，它反映了細(xì)胞增殖速度。測(cè)定群體細(xì)胞周期的辦法無數(shù)，主要有同位素標(biāo)志法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀測(cè)定等。這里主要介紹利用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(brdu）滲入測(cè)定細(xì)胞周期的辦法。 brdu加入培養(yǎng)液后，可代替摻入到所復(fù)制的dna新鏈中，經(jīng)過一輪復(fù)制，在每條染色單體的一條dna鏈均含有brdu，但經(jīng)染色后染色體卻仍為深染。經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含brdu的dna將占總數(shù)的1/2，反映在中期染色體上表現(xiàn)為其中