三七皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響

1、三七皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響         09-08-04 16:43:00     作者：周小寶    編輯：studa20【摘要】  目的：研究三七皂苷(PNS)對腦缺血再灌注后大鼠腦海馬和皮質(zhì)形態(tài)學(xué)變化、Bcl2、Bax蛋白表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用線栓改良法復(fù)制大鼠左側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，缺血2小時，再灌注24小時。將50只SD大鼠隨機(jī)分

2、為假手術(shù)組、模型組、三七皂苷組、尼莫地平組和三七皂苷加尼莫地平組（聯(lián)合用藥組），每組10只。分別采用HE染色檢測大鼠腦組織皮質(zhì)和海馬區(qū)病理改變，TUNEL法檢測各組腦內(nèi)皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡變化，免疫組化染色觀察各組大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)和海馬區(qū)Bcl2 、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠光鏡下細(xì)胞損傷變性程度輕；細(xì)胞凋亡率下降（P均<0.01），三七皂苷組與尼莫地平組相比，細(xì)胞凋亡率無顯著性差異（P>0.05），與聯(lián)合用藥組相比，有顯著性差異（P<0.01）；與模型組相比，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)和海馬Bcl2陽性細(xì)胞數(shù)

3、均明顯上升（P均<0.01），Bax陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)在相同時間點(diǎn)減少（P均<0.01）。結(jié)論：三七皂苷可抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用,其機(jī)制可能與Bcl2表達(dá)增高,Bax表達(dá)降低有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  大 鼠 腦缺血再灌注 細(xì)胞凋亡 Bcl2 Bax 三七皂苷noside,PNS),其塊根中含皂苷約12%1。三七在缺血缺氧性腦損傷防治中廣泛應(yīng)用,但其對腦缺血再灌注后海馬和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl2、Bax表達(dá)的影響報道較少。本實驗通過觀察三七皂苷對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討其抗腦缺血再灌注損

4、傷的作用機(jī)制。    1  實驗材料    1.1  動物及分組  健康SD大鼠50只,雌雄不拘，清潔級，體重250300g，由中英合資上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供動物許可證號：SCXK（滬）20030002，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動物房動物實驗室許可證號為SYXK（滬）20052008。大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、三七皂苷組、尼莫地平組、三七皂苷合尼莫地平組（聯(lián)合用藥組）,每組10只。    1.2  藥物及試劑

5、60; 三七皂苷注射液（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，商品名：血塞通注射液，規(guī)格：250mg/5ml/支），尼莫地平注射液（德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司,規(guī)格：10mg/50ml/支）；免疫組化檢測試劑盒Bcl2、Bax抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TUNEL試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。    1.3  主要儀器  LeicaRM20型石蠟切片機(jī)，Philips Tecnai12Biotwin型電子顯微鏡，MIQAS型病理圖像分析儀，SD78雙極電凝器。    2  實驗方法 

6、60;  2.1  給藥方法及劑量  根據(jù)人體臨床用藥劑量換算大鼠用藥劑量（相當(dāng)于人體用藥量的6.3倍）。三七皂苷組給予三七皂苷45mg/kg；尼莫地平組給予尼莫地平20mg/kg；聯(lián)合用藥組給予三七皂苷45mg/kg，加尼莫地平20mg/kg；假手術(shù)組和模型組給予相同體積的生理鹽水。造模前6天給予腹腔注射上述劑量藥物,第7天給藥30 min后造模,1天1次，造模后2小時給藥1次。給藥期間常規(guī)自由喂養(yǎng)、給水。    2.2  大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備及篩選0的強(qiáng)生尼龍線(直徑0.20mm,長50mm)入ECA殘端小口

7、內(nèi),將尼龍線緩慢沿ICA向顱內(nèi)推進(jìn),進(jìn)線約22mm,略感阻力，證明栓線頭端已達(dá)到大腦前動脈,阻斷了大腦中動脈的所有血液來源，包括來自頸內(nèi)動脈、大腦前動脈、大腦后動脈的血流，縫合切口。將尼龍線留置2個小時后，再灌注24小時將栓線抽出約10mm,拔線時有脫空感即止，將遠(yuǎn)端剪斷10mm，以防動物蘇醒后將線栓抓脫，導(dǎo)致大出血死亡。假手術(shù)組僅做頸動脈分離。    2.3  標(biāo)本取材  再灌注24小時后過量麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管后灌注生理鹽水250ml剪開右耳,快速沖洗，再用4%多聚甲醛250ml灌注,直到頭部變硬,斷頭取腦,取視交叉前后約

8、2030mm范圍的冠狀切片，放入10%福爾馬林中固定，24小時之內(nèi)石蠟包埋。     09-08-04 16:43:00     作者：周小寶    編輯：studa20    2.4  大腦皮質(zhì)和海馬病理學(xué)觀察  腦組織經(jīng)10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋，切片3m厚度,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。    2.5  免疫組化染色法  切片脫蠟置新鮮配置的3%H2O2，室溫處理2

9、0min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。將切片浸入001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加復(fù)合消化工作液至切片上，室溫孵育20min；以修復(fù)液 覆蓋組織切片20min，使抗原充分暴露。將切片浸入001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加封閉液 ，室溫處理20min后洗滌。滴加特異性一抗(bcl2，1100)。37濕盒孵育2小時。001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加封閉液，室溫處理20min，001 MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加特異性生物素化二抗(1100)，37濕盒孵育2小時。001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5

10、min。滴加SABC過氧化酶復(fù)合物，4濕盒過夜。001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加DABH2O2顯色液顯色。蘇木素輕度復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片。    實驗用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，以細(xì)胞漿棕黃色為陽性。采用圖像分析儀，每組分析10個標(biāo)本，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個不重疊的視野計皮質(zhì)和海馬區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。    26  TUNEL細(xì)胞凋亡檢測  將石蠟包埋標(biāo)本行冠狀切片，厚3m，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。光鏡下凋亡細(xì)胞核呈棕色。每張切片在200倍光鏡

11、下隨機(jī)選取5個不重疊的視野，輸入計算機(jī)進(jìn)行圖象分析，計算每個視野的凋亡細(xì)胞個數(shù)和正常細(xì)胞數(shù)，計算出細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。    27  統(tǒng)計學(xué)方法  所有數(shù)據(jù)用SPSS 130統(tǒng)計軟件分析處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA檢驗)，方差齊者組間比較用LSD檢驗，方差不齊者用GamesHowe 11檢驗，P<005表示有統(tǒng)計學(xué)意義。    3  實驗結(jié)果    3.1  腦組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察  假手術(shù)組缺

12、血側(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)偶見缺血壞死灶,細(xì)胞輪廓清楚,細(xì)胞排列整齊，胞核清晰,呈藍(lán)色，核仁可見;模型組缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)和海馬區(qū)可見輕度缺血壞死灶，有少量的細(xì)胞壞死變性，細(xì)胞核固縮、深染,甚者核溶解變形；三七皂苷組、尼莫地平組及聯(lián)合用藥組亦可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞輕度腫脹、皺縮,核仁可見。    3.2  各組大腦海馬和皮質(zhì)bcl2的表達(dá)  假手術(shù)組大鼠海馬可見少量Bcl2蛋白表達(dá)，主要存在于胞質(zhì),無明顯核表達(dá)；模型組缺血側(cè)Bcl2有較多的陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞清晰可見，細(xì)胞漿呈棕黃色染色，與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，三七皂苷

13、組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)和海馬Bcl2陽性表達(dá)均明顯增加（P均<0.01）；三七皂苷組與尼莫地平組比較，差異有顯著性意義（P<0.05），見表1。    3.3  各組大腦海馬和皮質(zhì)Bax表達(dá)  Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)可見少量Bax陽性細(xì)胞，模型組海馬區(qū)和皮質(zhì)Bax的陽性表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）；與模型組比較，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)Bax陽性表達(dá)明顯減少（P<0.01）；三七皂苷組與尼莫地平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0

14、.05）。三七皂苷組與聯(lián)合用藥組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。表1  各組海馬和皮質(zhì)Bcl2蛋白表達(dá)    與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，P<0.01；與尼莫地平組比較，P<0.05；與三七皂苷組和尼莫地平組比較，#P<0.01表2  各組大腦海馬和皮質(zhì)Bax表達(dá)（±s）平均陽性細(xì)胞數(shù)    3.4  各組腦組織細(xì)胞凋亡情況  假手術(shù)組腦組織TUNEL染色偶見凋亡細(xì)胞，模型組腦組織中可見大量凋亡細(xì)胞。光鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為胞核

15、被染成淡棕色。結(jié)果顯示，腦缺血再灌注24小時后，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組，差異有顯著性意義(P<0.01)；三七皂苷組、尼莫地平組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率下降，與模型組比較，差異有顯著性意義(P均<0.01)；三七皂苷組與尼莫地平組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)，與聯(lián)合用藥組比較，差異有顯著性意義(P<0.01)，見表3。表3  各組腦組織細(xì)胞凋亡情況4  討  論    隨著對腦缺血損傷機(jī)制研究的日益深入，細(xì)胞凋亡(apoptosis)在腦缺血再灌注中的作用引起關(guān)注。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是

16、缺血性腦損傷后細(xì)胞死亡的重要形式3。    細(xì)胞凋亡受多種相關(guān)基因及其蛋白調(diào)控,其中Bcl2 家族是目前最受重視的凋亡相關(guān)基因家族4。Bcl2家族既能阻抑壞死又能阻抑凋亡5,Bcl2 家族包括Bcl2、Bclx、Bax、mcl1、AL。一般認(rèn)為，Bcl2基因家族是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子，對維持腦缺血再灌注后某些神經(jīng)細(xì)胞的生存有重要作用。Bax蛋白存在于胞漿，是一種跨膜蛋白，含有192個氨基酸，與Bcl2具有21的同源性，其生物學(xué)作用是拮抗Bcl2。    三七具有化瘀止血、活血定痛之效。本草綱目記載該藥可散血、止血、定痛。藥理研究

17、認(rèn)為，三七活性成分為三七總皂苷(PNS),具有擴(kuò)張微細(xì)血管,降低血管阻力,增加腦血流量,降低血液黏度,抑制血栓形成等作用。本實驗結(jié)果顯示,HE染色光鏡下觀察，三七皂苷組腦組織損傷程度均較模型組輕,免疫組化染色結(jié)果表明,模型組Bcl2有表達(dá)，Bax與之相反,與文獻(xiàn)報道相符。三七皂苷與尼莫地平作用相似或略強(qiáng),無顯著性差異，聯(lián)合用藥組則效果略好。對大鼠大腦皮質(zhì)和海馬進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，三七皂苷能抑制皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元凋亡，對腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與三七皂苷上調(diào)腦缺血再灌注誘導(dǎo)的Bcl2 蛋白表達(dá),同時下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)有關(guān)。聯(lián)合用藥組效果略好，提示聯(lián)合用藥可能是防治腦缺血再灌注

18、損傷的一種治療思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】周小寶    編輯：studa20    2.4  大腦皮質(zhì)和海馬病理學(xué)觀察  腦組織經(jīng)10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋，切片3m厚度,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。    2.5  免疫組化染色法  切片脫蠟置新鮮配置的3%H2O2，室溫處理20min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。將切片浸入001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加復(fù)合消化工作液至切片上，室溫孵育20min；以修復(fù)液 覆蓋組織切片20min，使抗原

19、充分暴露。將切片浸入001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加封閉液 ，室溫處理20min后洗滌。滴加特異性一抗(bcl2，1100)。37濕盒孵育2小時。001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加封閉液，室溫處理20min，001 MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加特異性生物素化二抗(1100)，37濕盒孵育2小時。001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加SABC過氧化酶復(fù)合物，4濕盒過夜。001MPBS緩沖液中輕微振蕩洗滌3次，每次5min。滴加DABH2O2顯色液顯色。蘇木素輕度復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片。

20、    實驗用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，以細(xì)胞漿棕黃色為陽性。采用圖像分析儀，每組分析10個標(biāo)本，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個不重疊的視野計皮質(zhì)和海馬區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。    26  TUNEL細(xì)胞凋亡檢測  將石蠟包埋標(biāo)本行冠狀切片，厚3m，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。光鏡下凋亡細(xì)胞核呈棕色。每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個不重疊的視野，輸入計算機(jī)進(jìn)行圖象分析，計算每個視野的凋亡細(xì)胞個數(shù)和正常細(xì)胞數(shù)，計算出細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。    27  統(tǒng)計學(xué)

21、方法  所有數(shù)據(jù)用SPSS 130統(tǒng)計軟件分析處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA檢驗)，方差齊者組間比較用LSD檢驗，方差不齊者用GamesHowe 11檢驗，P<005表示有統(tǒng)計學(xué)意義。    3  實驗結(jié)果    3.1  腦組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察  假手術(shù)組缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)偶見缺血壞死灶,細(xì)胞輪廓清楚,細(xì)胞排列整齊，胞核清晰,呈藍(lán)色，核仁可見;模型組缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)和海馬區(qū)可見輕度缺血壞死灶，有少量的細(xì)胞壞死變性，細(xì)胞核固縮、深染,甚者核

22、溶解變形；三七皂苷組、尼莫地平組及聯(lián)合用藥組亦可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞輕度腫脹、皺縮,核仁可見。    3.2  各組大腦海馬和皮質(zhì)bcl2的表達(dá)  假手術(shù)組大鼠海馬可見少量Bcl2蛋白表達(dá)，主要存在于胞質(zhì),無明顯核表達(dá)；模型組缺血側(cè)Bcl2有較多的陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞清晰可見，細(xì)胞漿呈棕黃色染色，與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)和海馬Bcl2陽性表達(dá)均明顯增加（P均<0.01）；三七皂苷組與尼莫地平組比較，差異有顯著性意義（P<0.05），見表1。 

23、;   3.3  各組大腦海馬和皮質(zhì)Bax表達(dá)  Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)可見少量Bax陽性細(xì)胞，模型組海馬區(qū)和皮質(zhì)Bax的陽性表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）；與模型組比較，三七皂苷組、尼莫地平組、聯(lián)合用藥組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)Bax陽性表達(dá)明顯減少（P<0.01）；三七皂苷組與尼莫地平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。三七皂苷組與聯(lián)合用藥組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。表1  各組海馬和皮質(zhì)Bcl2蛋白表達(dá)    與假手術(shù)組比較

24、，*P<0.01；與模型組比較，P<0.01；與尼莫地平組比較，P<0.05；與三七皂苷組和尼莫地平組比較，#P<0.01表2  各組大腦海馬和皮質(zhì)Bax表達(dá)（±s）平均陽性細(xì)胞數(shù)    3.4  各組腦組織細(xì)胞凋亡情況  假手術(shù)組腦組織TUNEL染色偶見凋亡細(xì)胞，模型組腦組織中可見大量凋亡細(xì)胞。光鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為胞核被染成淡棕色。結(jié)果顯示，腦缺血再灌注24小時后，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組，差異有顯著性意義(P<0.01)；三七皂苷組、尼莫地平組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率下降，與模型組比較，差異有顯著性意義(P均<0.01