流式檢測(cè)細(xì)胞周期要點(diǎn)

1、流式檢測(cè)細(xì)胞周期要點(diǎn)：最關(guān)鍵的就是減少細(xì)胞碎片和單細(xì)胞懸液的制備！1、細(xì)胞消化要理想，資料顯示最好消化時(shí)加EDTA，可使流式做的很漂亮；2、細(xì)胞消化后不可吹打過(guò)度，減少細(xì)胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的細(xì)胞容易破碎；3、細(xì)胞用PBS洗滌離心，轉(zhuǎn)速不超過(guò)1000r/min，有文獻(xiàn)用800r/min；可考慮在此過(guò)程中用300目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾一遍細(xì)胞（有人主張用鋼網(wǎng)，以減少細(xì)胞與尼龍網(wǎng)粘連的損失，本人認(rèn)為鋼網(wǎng)易損傷細(xì)胞，DNA外溢也會(huì)造成細(xì)胞粘連，所以在細(xì)胞數(shù)足夠的情況下，首選尼龍網(wǎng)）；4、離心后的固定，標(biāo)準(zhǔn)做法是將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷70酒精，而不是向細(xì)胞中加酒精，這樣是為了減少細(xì)胞聚集，這一

2、點(diǎn)很重要，很多人都忽視了！5、一般選擇4固定過(guò)夜；6、加染液前的洗滌仍要注意離心轉(zhuǎn)速的問(wèn)題；7、關(guān)于PI染液的組成及配方，應(yīng)主要以文獻(xiàn)為主，PI（作用為DNA染色劑）的濃度從0.5科g/ml,20科0制150科g/m都見(jiàn)報(bào)道，響應(yīng)的求助顯示都可出良好結(jié)果，RNAs酶（由于PI也可染RNA,故要去除RNA）一般濃度為50g/ml,配方中的Triton-X-100（曲拉通）主要是通透細(xì)胞膜使PI能進(jìn)入細(xì)胞核。8、檢測(cè)時(shí)細(xì)胞要達(dá)到12X106個(gè)細(xì)胞（實(shí)際檢測(cè)是1萬(wàn)到2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞），為了既保持初始條件相同，又可搜集到足夠的細(xì)胞，應(yīng)選用多孔培養(yǎng)板，在搜集細(xì)胞時(shí)，濃度大、抑制強(qiáng)的組可多搜集些孔，以保證檢測(cè)的

3、細(xì)胞數(shù)量。如果細(xì)胞數(shù)量太低，技師為了減少對(duì)流式細(xì)胞儀的損傷，就會(huì)選擇高速流（一般的檢測(cè)用低速流，誤差小），檢測(cè)的質(zhì)量就會(huì)大大下降，數(shù)據(jù)的說(shuō)服力就下降了！1. 收集細(xì)胞；2. 2.30005000rpm離心5min,收集沉淀，重懸于200ul的PBS中，再次離心收集沉淀;3. 3.75冰凍乙醇（-20度保存）4度固定過(guò)夜or-20度固定1h；4. 4.離心收集沉淀，PBS洗一次（視沉淀量可忽略）；5. 5.沉淀重懸于200500ul的PBS,加入RnaseA37度水浴1h;6. 6.400目紗布過(guò)濾至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上機(jī)器。1、 Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍

4、體檢查，但取材后要等幾個(gè)星期才會(huì)做流式細(xì)胞術(shù)檢查，請(qǐng)問(wèn)：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定后再低溫下保存？A：我做過(guò)乳腺細(xì)胞的DNA含量測(cè)定，取得組織以后，先處理成單細(xì)胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細(xì)胞懸液可以至少保存12小時(shí)，最多可保存一個(gè)月，上機(jī)檢測(cè)前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個(gè)星期，結(jié)果還可以，變異系數(shù)為5%.2、實(shí)驗(yàn)中想用PI分析細(xì)胞周期及凋亡率，請(qǐng)教幾個(gè)問(wèn)題：Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？A：RNaseA用PBS配制沒(méi)有問(wèn)題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。Q：（2

5、）測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率時(shí)都要用RNAs酶，可以一起檢測(cè)嗎？A:用流式細(xì)胞儀測(cè)定時(shí)細(xì)胞周期和凋亡率是同時(shí)測(cè)定的，不用擔(dān)心Q：（3）Tritonx100是固定劑吧，用了70的冷乙醇（是4嗎？），是不是就不用Tritonx100固定了？A：TritonX-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75的乙醇于-20度固定。Q：（4）還要設(shè)什么內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)（5雞紅細(xì)胞）嗎？A:對(duì)照肯定是需要的，這個(gè)根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)置Q：（5）不用試劑盒行不行??？A:完全可以不用試劑盒。以下提供一個(gè)自己的實(shí)驗(yàn)步驟供參考：（1）200Xg離心10min收集細(xì)胞;2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的80%乙醇中，-

6、20°C固定24h以上；（3）進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)前，200Xg離心10min收集固定后的細(xì)胞;（4） PBS洗滌一次，200Xg離心10min收集細(xì)胞;5）將細(xì)胞重懸于含100ug/mlRNaseA和50ug/mlPI的PBS中，室溫孵育30min；（6）將經(jīng)PI染色和RNaseA消化后的細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過(guò)濾后即可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞定量的分析。3、 Q：流式檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)加RNA酶所需的溫度？A：其實(shí)有關(guān)RNA酶在凋亡檢測(cè)制樣過(guò)程中使用的必要性問(wèn)題尚有人持不同意見(jiàn)，該觀點(diǎn)的人認(rèn)為RNA酶在環(huán)境中無(wú)所不在，常規(guī)制樣過(guò)程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足

7、以降解樣品中的RNA，所以為了簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過(guò)經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI4度孵育30min”。至于染色時(shí)使用4度，是因?yàn)榈蜏乜蓽p弱分子運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細(xì)胞用75乙醇固定行嗎？4、 Q：我養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，測(cè)周期?？吹教诱f(shuō)70乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細(xì)胞會(huì)碎裂，有帖子說(shuō)PBS和乙醇配會(huì)出現(xiàn)絮狀物。上流式前細(xì)胞用75乙醇固定，就用買(mǎi)來(lái)的現(xiàn)成的瓶裝75乙醇，行嗎？必須那么嚴(yán)格嗎？A：先用冷PBS懸浮細(xì)胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞。之后

8、緩慢加入無(wú)水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞。乙醇固定之后沒(méi)有細(xì)胞沉淀。5、Q:我要做流式分析細(xì)胞周期，我大概收集了10的6次方細(xì)胞，但細(xì)胞在乙醇固定之后，還看到有細(xì)胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒(méi)什么細(xì)胞沉淀了，上機(jī)發(fā)現(xiàn)就發(fā)現(xiàn)不了細(xì)胞了。這是怎么回事??？怎么解決這個(gè)問(wèn)題??？A:很可能是洗細(xì)胞的過(guò)程中丟失了，解決辦法有：1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機(jī)2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時(shí)最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。（3）離心的轉(zhuǎn)速或時(shí)間可稍微增加一點(diǎn)兒（4）每次加抗體時(shí)，吸頭最好不要接

9、觸液面；混勻時(shí)最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。6、 Q：流式細(xì)胞PI單染中為什么用RNAse？A：在測(cè)細(xì)胞周期時(shí)，因?yàn)橐呀?jīng)在細(xì)胞膜打孔了，PI很容易透過(guò)細(xì)胞膜和DNA結(jié)合，但RNA也是核酸，也會(huì)被染色，為避免干擾染色前需用RNAse降解RNA。這樣PI只染DNA，能精確以熒光強(qiáng)度反映DNA的含量。7、最近做了幾次流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)問(wèn)題：Q：（1）我所用的是腫瘤細(xì)胞，但是同樣的細(xì)胞類(lèi)型，同樣的處理因素，雖然兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)作出來(lái)的結(jié)果總體趨勢(shì)都是在某種藥物干預(yù)后，S期比例下降，但兩次結(jié)果S期比列具體數(shù)值相差很大，同樣，G2/M期在干預(yù)前后無(wú)變化，但兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)值卻相差

10、很大，那么可以說(shuō)，做流式是每次細(xì)胞狀態(tài)不一樣，結(jié)果也會(huì)相差很大，是不是細(xì)胞密度會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大影響，那么如果細(xì)胞密度在60-70%時(shí)和細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)滿(mǎn)（90%以上）也會(huì)導(dǎo)致各期數(shù)值的差異？如果是這樣，長(zhǎng)滿(mǎn)的細(xì)胞（不再增殖）是表現(xiàn)的G1或S或G2/M上升還是下降？A:應(yīng)該是兩批細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)時(shí)本身所出周期不同所致，可以在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)胞的同步化處理，減少批間差異。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而不能是完全長(zhǎng)滿(mǎn)，一般在5080%比較好。自然狀態(tài)下，不增殖的細(xì)胞應(yīng)該處于G0/G1期。Q：（2）其次就是結(jié)果分析，細(xì)胞周期特異性藥物如抗代謝藥作用后主要表現(xiàn)的是S期比例下降，M 期，那細(xì)胞被阻滯在G1期，自然G1期比列

11、升高。而有些植物藥如長(zhǎng)春堿類(lèi)或紫杉醇類(lèi)，主要作用于么結(jié)果是否表現(xiàn)為G2期比例升高，還是S期也相應(yīng)升高？還有就是細(xì)胞經(jīng)抗腫瘤藥物作用后反而出現(xiàn)的S期升高，可能是那些原因，如何分析？A:周期特異性藥物阻滯哪一期，哪一期就升高，不會(huì)使其它階段細(xì)胞增多。8、 Q：我用流式做胃癌細(xì)胞周期分析時(shí)不出現(xiàn)S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能為PI沒(méi)染上色，是不是染色時(shí)間太短呢？A：你用了多少PI染色多久呢？一般來(lái)說(shuō)30分鐘夠了.我覺(jué)得可能是打孔或者rna沒(méi)有處理掉沒(méi)有成功，染色時(shí)間并不是關(guān)鍵。9、 Q：做流式細(xì)胞時(shí)，PI染色，PI的濃度應(yīng)該是多少?還有就是400目的篩網(wǎng)是什么？不用可以嗎？謝謝。A：100

12、ug/ml，一般用400目的篩網(wǎng)是用來(lái)將粘在一起的細(xì)胞團(tuán)濾掉的，否則會(huì)出現(xiàn)人為的多倍體干擾，分析的時(shí)候需要的是單個(gè)的細(xì)胞，不過(guò)如果經(jīng)驗(yàn)豐富也可以gate掉的。如果你沒(méi)有條件，建議在染色之前將細(xì)胞彈的很散，再進(jìn)行染色10、 、Q：流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期樣品怎樣準(zhǔn)備？A:給你介紹一下我的實(shí)驗(yàn)方法，我做的是周期檢測(cè)，要做平行樣，六孔板做的。（1）收集先棄液，將你要實(shí)驗(yàn)（你已經(jīng)處理好的）的細(xì)胞PBS洗兩次，加胰酶消化（注意：如果要是加藥物或者其他處理過(guò)的細(xì)胞，棄液和PBS洗液均收集）；（2）加培養(yǎng)基終止消化，打勻在分別收到各自離心管中（注意，收集過(guò)程中及后續(xù)過(guò)程中槍頭不要混用，要不平行樣也就沒(méi)意思了）；4）4度PBS（1到2ml）洗兩次，離心，1000rpm，5min棄液；（5）加入負(fù)20度70%酒精（1到2ml）打勻，固定，至少半個(gè)小時(shí)以上，（不做的話，可放入4度冰箱保存2-3周問(wèn)題不大）；（6）離心，1000rpm，5min棄酒精；（7）4度PBS（1到2ml）洗，離心1000rpm，5min棄液；（8）4度PBS（1到2ml）洗，打勻后，將細(xì)胞懸液用100目的紗布直接過(guò)濾到流式檢測(cè)管中；（9）離