丹酚酸B對內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

1、丹酚酸B對內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究                        【摘要】  目的：研究丹酚酸B對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷的保護(hù)作用,并探討其對HUVECs CD54表達(dá)和中性粒細(xì)胞黏附率的影響。方法:以H2O2為損傷劑，觀察丹酚酸B對HUVECs培養(yǎng)上清中LDH、NO、MDA含量的影響,并利用免疫組化方

2、法和顯微計數(shù)法觀察該藥對H2O2存在下CD54表達(dá)和中性粒細(xì)胞黏附率的影響。結(jié)果:丹酚酸B可劑量依賴性地減少H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞LDH外漏和MDA生成,并提高NO釋放,還能有效抑制H2O2存在下CD54表達(dá)和增加中性粒細(xì)胞黏附率。結(jié)論:丹酚酸B具有減輕H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞的氧化性損傷，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)胞黏附分子表達(dá)和抑制中性粒細(xì)胞黏附的作用，這一作用可能是丹酚酸B抗心肌缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】  丹酚酸B 內(nèi)皮細(xì)胞 CD54 中性粒細(xì)胞    丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干

3、燥根及根莖。丹參歸心、肝經(jīng),藥性微寒,味苦、無毒,具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。近年研究顯示，丹參有廣泛的生物活性，其治療心血管系統(tǒng)疾病的作用尤其受到關(guān)注，并已有相關(guān)藥物在臨床使用14。目前已有研究表明,其水溶性有效成分為治療心血管疾病的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，而丹酚酸B是其中較為重要的成分之一。目前關(guān)于丹酚酸B的研究主要集中于心肌缺血/再灌注損傷和缺氧/復(fù)氧損傷，而關(guān)于丹酚酸B對內(nèi)皮細(xì)胞氧化性損傷的研究尚未見報道。鑒于血管內(nèi)皮細(xì)胞所處的特殊位置（血液與間質(zhì)組織間的一層半透性的屏障）及其損傷對心肌缺血/再灌注損傷的重要影響，我們研究了丹酚酸B對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化性損傷的影響，以期為更全面了解

4、丹酚酸B的藥理作用提供相關(guān)依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  藥品、試劑和儀器    丹參注射液，生藥1.5  g·ml-1，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號0405202。肝素鈉注射液，常州生物千紅制藥有限公司，批號030212。RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品。新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號041030。胰蛋白酶（1250），Amresco分裝。3%雙氧水，南京興藍(lán)箭科技公司，批號200309011。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，

5、南京建成生物工程研究所，批號20050225。一氧化氮（NO）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20050112。丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20050203。Rabbit Anti CD54(ICAM1)，0.1 ml(200 g·ml-1)，武漢博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。Percoll，100 ml(1.131 g·ml-1),北京夏斯生物有限公司，批號301944。Beckman冷凍臺式離心機(jī)，美國Beckman公司。萊卡顯微工作站，德國

6、萊卡公司。精密移液器，吉爾森公司。Forma細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Forma公司。全自動高壓滅菌鍋，日本SANYO公司。超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠。24孔培養(yǎng)板，Costa公司。    12  藥物對H2O2所致HUVECs氧化損傷的影響    121  HUVECs的培養(yǎng)及氧化損傷模型的建立5  HUVECs按常規(guī)方法復(fù)蘇后接種于40 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37、95% O2、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底后，加入0.25%胰蛋白酶37 消化23 min，

7、用新生牛血清終止消化。將細(xì)胞懸液移入離心管，1 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108 L-1的細(xì)胞懸液，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿單層融合后，棄去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使其同步化生長，即可用于試驗。接種于24孔板的HUVECs同步化生長后，加入含有終濃度為200 mol·L-1 H2O2的無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，作用24 h。    122  實驗分組  （1)正常對照組：無血清的RPMI 1

8、640培養(yǎng)液；（2）模型組：無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液加200 mol·L-1  H2O2作用24 h；（3）丹參注射液組：加入含有丹參注射液終質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（4）丹酚酸B低劑量組：加入含有丹酚酸B終質(zhì)量濃度為1×10-6 g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（5）丹酚酸B中劑量組：加入含有丹酚酸B終質(zhì)量濃度為1×10-5 g·L-1的培養(yǎng)液

9、預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（6）丹酚酸B高劑量組：加入含有丹酚酸B終質(zhì)量濃度為1×10-4g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h。    123  細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及生化指標(biāo)測定  各組HUVECs經(jīng)H2O2處理24 h后，于相差倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，并檢測培養(yǎng)液中LDH、NO、MDA含量。    13  HUVECs CD54表達(dá)的測定方法 &

10、#160;  將HUVECs按1×10-4ml-1的密度接種于預(yù)先鋪有玻片（5 mm×5 mm）直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中4塊玻片。37、95% O2、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%融合后吸去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使其同步化生長，即可用于實驗。    將長滿細(xì)胞的涂片從培養(yǎng)皿中取出，置于冰丙酮（100%）中固定10 min，晾干。將固定好的玻片用502膠固定于載玻片上，放入4冰箱中備用。取出4冰箱中的載玻片，用PBS潤洗1 min，晾干。30% H2O2  1份+純甲醇50份混合

11、，將載玻片置于其中浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水潤洗3次，晾干。滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。滴加Rabbit Anti CD54抗體，稀釋度為1100，4過夜,PBS潤洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗兔IgG，濕盒中37 20 min，PBS潤洗3次，每次2 min。加試劑SABC，37 20 min，PBS潤洗4次，每次5 min。使用DAB試劑盒顯色，取1 ml蒸餾水加試劑A、B、C各1滴，混勻后加至載玻片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間530 min，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。  &#

12、160; 免疫組化染色陰性對照：用PBS代替Rabbit Anti CD54抗體4過夜，其余步驟同上。    每張切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)40×40下，隨機(jī)選取10個視野，計算平均單個視野CD54陽性細(xì)胞數(shù)。    14  HUVECs與嗜中性多形核白細(xì)胞（PMN）黏附率的測定    PMN的分離6：按文獻(xiàn)所述方法將分離所得的PMN用無血清的RPMI 1640混懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108  L-1，備用。    15  統(tǒng)計學(xué)處理

13、    所得數(shù)據(jù)用 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果進(jìn)行Studentst檢驗。                                 2  結(jié)    果    21 

14、HUVECs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察    正常對照組HUVECs細(xì)胞呈棱形、三角形或多角形，融合成片后的細(xì)胞呈鵝卵石狀鑲嵌排列。經(jīng)H2O2處理后的模型組，可見細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間隙明顯增寬，細(xì)胞皺縮成球形，有的細(xì)胞腫脹、變圓，折光率下降，多數(shù)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落而懸浮在培養(yǎng)液中，部分已經(jīng)自溶。經(jīng)丹酚酸B預(yù)處理的HUVECs能明顯地減輕H2O2對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，大部分細(xì)胞仍成片貼壁生長，細(xì)胞間隙無明顯改變，部分細(xì)胞折光率降低，無明顯的細(xì)胞皺縮、腫脹、變圓的現(xiàn)象。因此，丹酚酸B對H2O2 處理所導(dǎo)致的HUVECs氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。見圖1。  &#

15、160; 22  丹酚酸B對H2O2所致HUVECs 上清液中LDH含量、NO釋放及MDA生成的影響    H2O2損傷使得HUVECs上清液中LDH增多，與正常對照組比較，差異顯著（P<0.01）。丹酚酸B中、高劑量組可明顯減少氧化損傷所致上清液中LDH的增多（P<0.05，P<0.01）。見表1。    經(jīng)過H2O2處理后，HUVECs釋放的NO減少，與正常對照組比較，差異顯著（P<0.05）。丹酚酸B高劑量組能有效改善損傷細(xì)胞NO的釋放（P<0.05）。   

16、 另外，由于H2O2的氧化損傷，使得HUVECs上清液中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成明顯增多，與正常對照組比較，差異顯著（P<0.01），丹酚酸B高劑量組能抑制MDA的釋放，使HUVECs脂質(zhì)過氧化程度降低（P<0.05）。圖1  丹酚酸B對H2O2處理的HUVECs形態(tài)學(xué)的影響表1  丹酚酸B對H2O2所致HUVECs上清液中LDH含量、NO釋放及MDA生成的影響 HUVECs經(jīng)過H2O2處理后，CD54的表達(dá)明顯升高，與正常對照組比較，有顯著性差異（P<0.01），并且，隨著時間的延長，陽性細(xì)胞數(shù)有增多的趨勢（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)丹酚酸B 1×10

17、-4、1×10-5預(yù)處理的HUVECs，其CD54的表達(dá)有所抑制，與模型組比較，差異顯著（P<0.05，P<0.01）。    2.4  丹酚酸B對HUVECs與黏附率的影響    HUVECs經(jīng)過H2O2處理后，CD54表達(dá)增加的同時，PMN與HUVECs的黏附率也有所升高，與正常對照組比較，有顯著性差異（P<0.01），并且，隨著時間的延長，PMN的黏附率也相應(yīng)增加。經(jīng)丹酚酸B 1×10-4、1×10-5預(yù)處理的HUVECs，其與PMN的黏附減少，與模型組比較，差異顯著（P

18、<0.05）。    3  討    論    目前，已有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅是作為血液與血管間的生理屏障而存在，還能分泌多種活性物質(zhì)而對心血管系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。心臟一旦供血供氧不足，首先受到影響的感受器就是血管內(nèi)皮細(xì)胞。正常的內(nèi)皮功能一旦受到破壞，就可通過多種途徑反過來影響心肌缺血病程的發(fā)展。    血管內(nèi)皮源性活性氧（ROS）的激活增多以及ROS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，首先是在觀察缺血再灌注損傷的病變過程中發(fā)現(xiàn)的7。在缺血再灌注導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的機(jī)制

19、中，內(nèi)皮細(xì)胞的氧化性損傷是最主要的原因之一。內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的ROS主要包括O-2、H2O2、ONOO-、NO和OH-。過氧化氫作為活性氧家族中的一員8 ,可直接作用于膜脂質(zhì),形成脂質(zhì)過氧化物,從而使MDA 生成增加,質(zhì)膜通透性增加,外鈣內(nèi)流增多,LDH 漏出也增多;H2O2還能通過抑制Na+K+ATP酶活性,使胞內(nèi)鈣不能排出,導(dǎo)致鈣超載,并且H2O2可直接損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng),使其喪失緩沖調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的能力。異常升高的鈣可能通過啟動黃嘌呤黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)或花生四烯酸系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基及其他細(xì)胞毒物質(zhì),并可加劇線粒體功能障礙,使氧化磷酸化紊亂,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。  &#

20、160; 本實驗中在采用200 mol·L-1 H2O2處理后，HUVECs培養(yǎng)液中LDH的含量顯著增多，MDA的釋放量也明顯增加，這說明HUVECs確實受到了H2O2的損傷，并且脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度增加。與此同時，HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量明顯減少，這表明血管內(nèi)皮功能出現(xiàn)紊亂。本實驗結(jié)果表明，丹酚酸B可以降低HUVECs損傷后LDH的釋放，減輕脂質(zhì)過氧化程度，并有效調(diào)節(jié)NO的釋放，此結(jié)果與在大鼠身上獲得的結(jié)果相符合，進(jìn)一步驗證了丹酚酸B確實對血管內(nèi)皮系統(tǒng)具有保護(hù)性調(diào)節(jié)作用。有研究表明，丹酚酸B具有較高的清除自由基活性,該物質(zhì)所表現(xiàn)出來的治療心、腦血管疾病的作用可能與其抗自由基活性

21、有關(guān)9。而本實驗中丹酚酸B所顯示出的對H2O2所致的內(nèi)皮細(xì)胞氧化性損傷的拮抗作用印證了上述結(jié)論。    近些年來的基礎(chǔ)與臨床研究表明,炎癥反應(yīng)在缺血性心臟病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。無論是在充血性或是缺血性的心肌疾病中，都伴有標(biāo)志炎癥反應(yīng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的上調(diào)。    在心肌缺血尤其是在缺血后再灌注損傷過程中，中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞發(fā)生的黏附作用可通過多種機(jī)制造成血管功能障礙及組織損傷。此外，中性粒細(xì)胞是氧自由基產(chǎn)生的一個重要的途徑。缺血期間，中性粒細(xì)胞進(jìn)入缺血組織，細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增加，白細(xì)胞聚集，促使細(xì)胞膜脫顆粒，釋放蛋白水解酶，炎癥浸潤線粒體，致使呼吸鏈電子傳遞受損，耗氧量增加，所攝取的氧經(jīng)NADPH氧化酶作用而形成自由基。    CD54為免疫球蛋白超家族黏附分子，在靜息狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈低水平表達(dá)，但在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中如自由基存在條件下，能迅速表達(dá)上調(diào)。    本實驗中利用H2O2來誘導(dǎo)HUV