幽門螺桿菌工程疫苗研究進(jìn)展

1、謝謝觀賞幽門螺桿菌工程疫苗研究進(jìn)展幽門螺桿菌是慢性胃炎、 消化性潰瘍及胃腸道淋巴瘤的主要致病因素， 并與胃癌發(fā)生密 切相關(guān)， WHO 將其列為第一級致癌物質(zhì)，流行病學(xué)調(diào)查表明，我國是胃癌癌的高發(fā)區(qū)及 Hp高感染區(qū)，已對人民健康造成重大危害，盡管抗生素治療在HP相關(guān)性治療方面取得了較大進(jìn)展。 但其毒副作用明顯， 療效不穩(wěn)定， 無法解決其復(fù)發(fā)問題，人類與病原微生物的長 期斗爭歷史表明，醫(yī)學(xué)教育 '網(wǎng)搜集整理有效控制和徹底消滅某種傳染病的最佳途徑是疫苗接種， Hp 疫苗接種將是預(yù)防 Hp 感染， 降低 Hp 相關(guān)性疾病發(fā)病率的最佳選擇。 1995 年費城 會議上Rapuoli指出開發(fā)Hp疫苗

2、需要至關(guān)重要的三種成分：必須現(xiàn)能干擾粘附和毒性且 存在于所有菌株的保護(hù)性抗原。如尿素酶、熱休克蛋白60、粘附素等；臨床前試驗需要能模擬感染和疾病的動物模型，一種新的 Hp 感染小鼠需要新鮮的臨床分離株來感染小鼠， 這一模型能重復(fù)人體疾病的諸多臨床表現(xiàn)， 如上皮細(xì)胞損害和炎癥等； 需要有適用人體的 粘膜佐劑，比較肯定的有霍亂毒素B亞單位、大腸桿菌熱敏毒素B亞單位等。1. 抗原基因的選擇研究疫苗的首要任務(wù)便是尋找免疫原， Lazowskaetal 在 HP 蛋白免疫原的尋找方面作了較為出色的工作，最初應(yīng)用全菌抗原和膜佐劑口服免疫Hp 感染的小鼠，成功誘導(dǎo)小鼠保護(hù)性免疫反應(yīng)，醫(yī)學(xué)教育 '網(wǎng)搜

3、集整理但全菌抗原成分復(fù)雜，副反應(yīng)多，研 制 Hp 亞單位疫苗成為必然。 HpUre 基因組，由 A， B， C， D 四個亞基基因組成，基因結(jié)構(gòu) 已清楚，其中 A ， C， D 亞基免疫原性差，其免疫保護(hù)作用十分微弱，僅有 UreB 亞基能產(chǎn) 生保護(hù)性免疫， 是疫苗和診斷用抗原的主要候選基因之一； CagA 基因較大，編碼分子量 94KD 的細(xì)胞毒性相關(guān)蛋白，是 Hp的主要致病因子。因此研究UreB或CagA相關(guān)的疫苗將能有效預(yù)防致病 Hp 的感染和發(fā)病， Ure 作為候選菌苗有許多優(yōu)點：在菌株中含量豐富， 分布在細(xì)菌表面， 廣泛表達(dá)和高度保守； 其大分子量和顆粒狀結(jié)構(gòu) 也更有利于粘膜免疫接種

4、。 Pappoetal 用純化的 HelicobacterfelisUreB 亞單位和 CT 口服免疫 小鼠后可抗 Hf 定植，而 UreA 亞單位則無保護(hù)作用， UreB 亞互單位和 LT 口服免疫小鼠， 同樣產(chǎn)生抗 Hf 感染保護(hù)力，重組的 Ure 和 LT 口服、鼻腔、直腸免疫同樣能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn) 生免疫保護(hù)力，Ure抗體被動免疫小鼠后也能預(yù)防Hf感染的事實，間接說明 Ure誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)力是體液免疫應(yīng)答介導(dǎo)的，螺桿菌屬的 Ure 同源性非常高， HpUreB 亞單位和佐 劑CT 口服免疫小鼠可抗 Hf感染的事實，說明螺桿菌屬的Ure存在交叉性表位，免疫后可引起交叉性保護(hù)，目前在小鼠模

5、型上已證實多種Hp抗原包括VacA，Ure，CagA，過氧化氫酶、 HpGroES 類蛋白等。都可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)力。疫苗能否清除已有的感染？ Doidge 采用 Hp 超聲裂解物和重組 UreB 亞單位，結(jié)合 CT 口服免疫慢性Hp感染小鼠，結(jié)果證實口服免疫兼具預(yù)防和治療雙重作用，Doidge在Hm感染的雪貂中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。 Ghiaraetal 研究了 Hp 相關(guān)抗原作為疫苗治療慢性 Hp 感染效果， 同時也試驗大腸桿菌突變脫毒腸毒素作為粘膜佐劑的可能性，結(jié)果表明不管是 Hp 超聲裂解物或者重組蛋白 VacA和CagA，與UTK 63一起免疫，都成功地清除了小鼠體內(nèi)已有的Hp，并且免

6、疫 3mo 后仍無感染， Marchettietal 實驗了 LT， LTK 63佐劑與全菌、 內(nèi)源性 VacA， Ure， CagA及重組VacA，CagA的免疫保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)都可激發(fā)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)。2. 關(guān)于佐劑粘膜免疫需要強(qiáng)的佐劑以提高抗原的免疫原性，粘膜佐劑可刺激Th 2型粘膜免疫反應(yīng)。 未來的 Hp 疫苗必須輔以能有效誘導(dǎo)粘膜免疫的佐劑，活化 Th 2 細(xì)胞免疫途徑，才能產(chǎn)生大量的slgA，才能克服Hp抗原性弱的問題。CT和LT是目前研究最為深入的粘膜 免疫佐劑，它們都具有較強(qiáng)的粘膜免疫原性和粘膜佐劑效應(yīng)，與不相關(guān)可溶性蛋白抗原同時口服免疫機(jī)體，能消除機(jī)體對這些免疫蛋白的耐受性，誘

7、導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對CT及其免疫蛋白的長期免疫記憶。它們都能促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的抗原呈遞，選擇性誘導(dǎo)抗原特異性Th2 細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的有絲分裂和B細(xì)胞種型分化，但由于CT 口服時在某些品系小鼠誘生超敏反應(yīng)，而改用 CT-B 單位即可避免，故有人認(rèn)為 CT-B 是至今為止最為有效最為安全的粘膜 免疫佐劑之一， 目前人們更為親睞 LT-B ，因為 LT-B 較 CT-B 擁有更可靠的安全性和有效性， Michertietal 在臨床實驗了重組 HpUre 和 LT 口服免疫 Hp 染的志愿者的安全性和免疫原性， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療患者僅出現(xiàn)腹瀉等， 較少的副反應(yīng)； 而使用脫毒 LT 可避免以上副反

8、應(yīng)。 LTK 63 與 LT 區(qū)別在于絲氨酸取代了第 63位的賴氨酸， LTK 63作為粘膜佐劑在動物模型上已成功誘 導(dǎo)抗原特異的體液免疫反應(yīng)和風(fēng)疹病毒特異的毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)，因此LTK63 作為佐劑完全可能在未來臨床中用于 Hp 治療性免疫。最近 Kinetal 采用聚微囊包襄的全菌抗原口服免 疫小鼠同樣可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的系統(tǒng)和粘膜免疫，免疫8wk后，胃腸液中抗HPsIgA和血清 lgG 仍維持較高平， Hp 菌攻擊小鼠保護(hù)率高達(dá) 95%，與 CT， LT 佐劑組對比無顯著差異， 表明聚微襄顆粒可以誘導(dǎo)針對 Hp 特異系統(tǒng)和粘膜免疫， 并且可以作為未來 Hp 疫苗的佐劑。3. 關(guān)于疫苗蛋白

9、質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)及抗原表位預(yù)測抗體分子在抗原上的結(jié)合位點稱為抗原決定簇， 又稱抗原表位。 它是蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)， 常出現(xiàn)在分子的高暴露區(qū)域， 其性質(zhì)、 數(shù)目及空間的構(gòu)型決定其抗原特性， 為精確描述抗原決定簇， 可用同源蛋白質(zhì)來評價特定氨 基酸替換的影響以確定抗原表位的所在區(qū)， 不過這里的表位是指 “功能表位 ”，即一種蛋白質(zhì) 能在免疫檢測中結(jié)合抗體的那一部分或片段、 因此研究某種蛋白質(zhì)有意義的亞單位結(jié)構(gòu)和功 能，它在實驗使用上有買際意義。利用計算機(jī)軟件可以預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和抗原位點，這可作為抗原多肽合成試驗的選段參考，適當(dāng)左右擴(kuò)展成1020肽，也可用作抗原克隆表達(dá)實驗前 PCR 引物設(shè)計時

10、模板范圍選擇的參考，使擴(kuò)增出的序列能夠覆蓋較多的預(yù)測點， 這對我們研制 Hp 基因工程疫苗有重要指導(dǎo)意義。4. Hp疫菌的免疫保護(hù)機(jī)制免疫應(yīng)答類型的確定直接決定人類疫苗學(xué)研究發(fā)展，Hp感染的免疫應(yīng)答類型很難確定，這是因為自然感染Hp后，引起的免疫反應(yīng)無保護(hù)性；而感染Hp 的嚙齒類動物，采用經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)很難分析疫苗的治療性免疫應(yīng)答機(jī)制。最近有報道 在Hp感染者胃粘膜中slgA水平明顯高于對照組，提示粘膜slgA在抗Hp感染中具有重要作 用， Doigeetal 用 Hf 超聲裂解物免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)抗螺桿菌 slgA 水平與保護(hù)作用密切相關(guān)。 T 淋巴細(xì)胞在Hp感染中的保護(hù)作用目前知之甚少。Hp感

11、染患者外周血單核細(xì)胞的刺激和抑制作用已有報道，Hp感染的小鼠和人類，THI細(xì)胞被抑制，小鼠的保護(hù)性免疫與THi細(xì)胞抑制和 TH 2細(xì)胞活化密切相關(guān)。 目前 Hp 疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫和治療作用的機(jī)制仍 不清楚，Ghiaraetal認(rèn)為疫苗可能改變胃內(nèi)Thl型應(yīng)答反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)?TH O或Th2型保護(hù)性反應(yīng)；并且在慢性 Hp感染小鼠模型中出 TH!細(xì)胞反應(yīng)口服Hp菌苗誘導(dǎo)THo或Th2細(xì)胞活化 反應(yīng)，清除體內(nèi)感染的細(xì)菌，Hp感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn) Th2反應(yīng)刺激程度與胃粘膜內(nèi)細(xì)菌減少和胃炎消退密切相關(guān)，Hp免疫小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IFN- 丫下清Thi反應(yīng)，胃內(nèi)Th2細(xì)胞分泌IL-4 水平增高；體外

12、培養(yǎng) Hp 免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)大量脾細(xì)胞中有 Hp 特異 Th2 細(xì)胞，脾細(xì)胞 接種其他動物發(fā)現(xiàn)明顯減少胃內(nèi) Hp 感染量。 Mohammadietal 也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，并證明 IL-4 基因敲除小鼠體內(nèi) Hp 感染數(shù)量明顯高于對照組，目前研究表明Hp 慢性感染人群 Thl 細(xì)胞反應(yīng)占主要地位， 人類胃粘膜反應(yīng)是否與小鼠相同？如果類似，采用無毒粘膜佐劑， 治療性疫苗可能是清除 Hp 感染的新的方法。5. Hp 感染的動物模型 研制 Hp 疫苗的先決條件是必須建立合適、穩(wěn)定的 Hp 慢性感染 動物模型， 以分析免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)機(jī)制。 在螺桿菌屬細(xì)菌中， Hf 與 Hp 的生化特征和生 物學(xué)行為最

13、為接近，其16SDNA基因序列與Hp的同源性高達(dá)94.6% , Ure、過氧化物酶、過氧化氫酶均為陽性，生長條件相近，還具有相對較廣的宿主范圍，Hf 在小鼠胃內(nèi)的定植無明顯部位特異性，與人 Hp 胃內(nèi)定植部位基本一致，并能引起與人類 Hp 相關(guān)胃炎相似的病 理改變。王繼德博士 etal研究證實無特殊病原菌級Balb/c小鼠對Hf易感，25只小鼠的感染成功率為 100%，并能在胃內(nèi)長期存活達(dá) 16wk 以上，用 ELISA 法在感染 16wk 以后的小鼠 血清、 胃腸液中可檢出抗 Hf-lgG 抗體， 并發(fā)現(xiàn)該抗體與 Hp 抗原有明顯的交叉反應(yīng)， 這證明 兩種細(xì)菌有許多共同免疫原， Hp 定植成

14、功的有悉生豬、 狗和無胸腺小鼠。 但這些動物昂貴， 需特殊飼養(yǎng)條件，且允許觀察時間不足1mo,國內(nèi)學(xué)者陳晶晶1990年最道了 Hp的wistar大鼠模型的成功復(fù)制，但不足之處在于Hp定植時間不超過1mo.有報道用靈長類動物復(fù)制Hp 模型，由于靈長類動物胃內(nèi)生理結(jié)構(gòu)與人類高度相似，可望獲得長期感染，但該純系動 物不易獲得，飼養(yǎng)困難，價格昂貴。另外由于 Hp 的動物宿主譜較窄，其動物感染模型尤其 是常規(guī)小動物長期感染模型的建立，向未兄有成功的報道。故人們在研究中廣泛應(yīng)Hp的近緣菌感染小動物模型， Hf 小鼠模型是最常用的一種。6. Hp 減毒沙門疫苗 沙門菌是寄生于人和動物腸道的革蘭陰性菌，它可以

15、作為其他病 毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體的蛋白、抗原或表位的表達(dá)載體，向機(jī)體輸送單價或多價抗原， 誘發(fā)系統(tǒng)免疫和粘膜免疫， 沙門菌通過其自然感染方式經(jīng)過粘膜侵入呼吸道、 消化道、 雌性 生殖道等粘膜淋巴組織， M 細(xì)胞取和運輸抗原。觸發(fā)粘膜免疫反應(yīng)，剌激 slgA 特異的 B 細(xì) 胞向其他粘膜組織遷移并分化成漿細(xì)胞，分泌 slgA 釋放到粘膜表面， 防止病原體再度感染。此外沙門菌也可隨血流分布到機(jī)體的肝、脾和淋巴結(jié)等處， 寄居在單核巨噬細(xì)胞中， 激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答， 減毒沙門活菌疫苗表達(dá)的外源蛋白，無論采用口服免疫、鼻腔免疫、直腸免 疫或陰道免疫， 都能誘導(dǎo)哺乳動物產(chǎn)生顯著而特異的免疫應(yīng)答， 包括

16、全身和粘膜的體液免疫 應(yīng)答。目前沙門菌載體菌苗系統(tǒng)常見的突變株包括： Ty21a， aro， asd， cya， crp 等突變株， 其中 aro 基因突變株不僅高度減毒，而且具有良好的免疫原性，被廣泛用作表達(dá)多種異源抗 原的載體，而cya，crp突變株不僅減毒具有免疫原性，而且是雙基因突變，回復(fù)突變的可 能性極小， 因此用該突變株作為載體菌苗很安全。 目前減毒沙門菌疫苗研究多利用其天然宿 主-小鼠來研究外源蛋白的免疫源性，人類應(yīng)用減毒沙門菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果， 目前Hp減毒沙門菌苗載體多為沙門菌突變株，如aro、phoPc等。Gomez-Durateetal用表達(dá)HpUreA，B亞單

17、位的減毒沙門菌 SL3261aro突變株，口服免疫 Balb/c, C57/B6小鼠，然 后用野生株攻擊，免疫組獲100%保護(hù)，對照組則無保護(hù)作用，血清、胃粘液中抗Ure 抗體均升高，說明減毒沙門菌能表達(dá)強(qiáng)免疫源性UrE.Corthesyetal用表達(dá)Ure的phoPc突變株鼻腔免疫小鼠也獲得了滿意的保護(hù)率，能誘導(dǎo)體液吏疫和細(xì)胞免疫，并刺激T 細(xì)胞增殖、分泌IFNy, IL-2.IL-4 , IL-5 , IL-6等細(xì)胞因子，說明沙門菌表達(dá)的Ure特異誘導(dǎo)了 Thb Th?等淋巴細(xì)胞反應(yīng)。但是 Hp減毒活疫苗的研究尚有許多困難待克服：宿主對Hp減毒沙門菌苗的免疫應(yīng)答機(jī)制及 Hp 菌逃避甚至破壞機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)制尚不清楚； 需進(jìn)一步提高 減毒沙門活菌疫苗的安全性和免疫原性；研制穩(wěn)定、高效表達(dá)Hp精制亞單位抗原的減毒沙門活菌疫苗。 Hp 感染與潰瘍和胃癌的相關(guān)性己廣為接受，耐藥苗株不斷增多以及發(fā)展中 國家 Hp 感染率不斷增高的事實， 使我們只有寄希望于疫苗來根治和預(yù)防Hp 感染。 國外