細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、授課章節(jié)名稱第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法授課 時數(shù)2教學(xué)目 的1 1、使學(xué)生掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法，了解主要工具，側(cè)重掌握基 本原理和基本應(yīng)用2 2、了解細(xì)胞組分的分析方法及細(xì)胞培養(yǎng)3 3、了解細(xì)胞工程技術(shù)教學(xué)要 求1 1、掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法，掌握光學(xué)顯微鏡技術(shù)2 2、了解細(xì)胞組分的分析方法及細(xì)胞培養(yǎng)3 3、了解細(xì)胞工程技術(shù)教學(xué)重占八、1 1、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法2 2、細(xì)胞組分的分析方法及細(xì)胞培養(yǎng)。教學(xué)難占八、1 1、觀察細(xì)胞形態(tài)的主要方法及工具的介紹。2 2、細(xì)胞組分的分析方法教學(xué) 方法與手段講授法、互動討論法作業(yè)與 思考題部分課后作業(yè)閱讀 書目或4 -IV.參考 資料1 1、

2、細(xì)胞生物學(xué)（第 3 3 版）（翟中和等）（）（高等教育出版社）（20092009）2 2、細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)展（鄭國錩等）（高等教育出版社）（19941994）3 3、分子細(xì)胞生物學(xué)（韓貽仁）（高等教育出版社）（20072007）第頁章（節(jié)、目）授課計劃教 學(xué) 后 記課時教學(xué)內(nèi)容頁教學(xué)內(nèi)容小結(jié)技術(shù)的進(jìn)步在一門學(xué)科的建立與發(fā)展過程中起著巨大的作用。沒有 顯微鏡的發(fā)明就沒有細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，更不會有細(xì)胞學(xué)說的建立，沒有電子顯微技 術(shù)及其分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，就不會有細(xì)胞生物學(xué)今天的發(fā)展。細(xì)胞生物學(xué)研究方法：一般來說，凡是用來解決細(xì)胞生物學(xué)問題所采用的 方法，都屬于細(xì)胞生物學(xué)研究方法。當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)研究中常用到

3、的方法有：核酸和蛋白質(zhì)成分的分析和序列測定、研究特異DNA RNA 常用的 southern 雜交、Northwre 雜交及蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、基因打靶技術(shù)等等。第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、有關(guān)顯微鏡的一些概念(1) 分辨率(resolution ):指分辨物體最小間隔的能力。光學(xué)顯微鏡的分辨率 R=0.61 入/ N. sin(a/2 ).?其中入為入射光線波長；? N =介質(zhì)折射率；空氣中 N =1?a二物鏡鏡口角(樣品對物鏡鏡口的張角)。(2) 放大倍數(shù)(magnification ):是指眼睛看到像的大小與對應(yīng)標(biāo)本大小的比 值。它指的是長度的比值而不是面積的比值。例：放大倍數(shù)為 1

4、00X，指的是長度是 1 卩 m 的標(biāo)本，放大后像的長度是 100卩 m 要是以面積計算，則放大了 10,000 倍。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。(3)有效放大倍數(shù)(effective magnification ):物鏡的數(shù)值孔徑(NA決定 了顯微鏡有效放大倍數(shù)。有效放大倍數(shù)，就是人眼能夠分辨的 d 與物鏡的 d 間的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍數(shù)：M=d /d二、顯微鏡的分類現(xiàn)代顯微鏡可以分為兩大類：一類是光學(xué)顯微鏡，另一類是非光學(xué)教學(xué)內(nèi)容小結(jié)顯微鏡。這兩類顯微鏡又可根據(jù)不同的情況分成若干類型。二、光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)至今仍是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段。（

5、一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)1. 構(gòu)成：1照明系統(tǒng)：光源、折光鏡、聚光鏡2光學(xué)放大系統(tǒng)：為兩組玻璃透鏡，目鏡與物鏡機(jī)械裝置和支架系統(tǒng)，由 鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、推動器、 粗動螺旋和微動螺旋等部件組成，保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配置和靈活調(diào)控。2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。教學(xué)內(nèi)容：小結(jié):（二）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)光線在通過密度不同的介質(zhì)時，其滯留程度不同，即產(chǎn)生了光程差和相位差。 相差顯微鏡的基本原理把光程差變成振幅差（即明暗）。從而提高樣品反差，提 咼了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，明暗差別通過密度差形成使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本，樣品不需染色，適合觀

6、察活細(xì)胞。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動態(tài)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。1. 環(huán)形光闌（annular diaphragm ）:位于光源與聚光器之間。2.相位板（annular phaseplate ）:物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將 直射光或衍射光的相位推遲 1/4 入。微分干涉顯微鏡用的是偏振光，增加了樣品反差，并具有立體感，可作于 研究活體細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)（三）熒光顯微鏡技術(shù)特點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片（激發(fā)光濾片，阻斷濾片）照明方式通常為落射式（這種照明的光束來自物體的上方通過物鏡后射到被檢物體上，這樣物鏡又起著聚光鏡的作用

7、。這種照明法是適用于非透明物體，檢出能力高；對細(xì)胞的刺激??；能進(jìn)行多重染色）。原理：細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一 些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照 射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡可對這類物質(zhì)進(jìn)仃疋性和疋里研究。光源為糸外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物 大分子的定性定位最有力的工具應(yīng)用：直接熒光標(biāo)記技術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（四）激光共聚焦顯微技術(shù)原理和應(yīng)用：激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal seanning microscope ）用激光作掃描光源，逐點、逐仃、逐面快速掃描成像

8、，掃描的激 光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點（所謂共焦，是 指物鏡和聚光鏡同時聚焦在同一點上），也是瞬時成像的物點。由于激光束的 波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通 光學(xué)顯微鏡的 3 倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)，調(diào)焦深 度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算 機(jī)內(nèi)，通過計算機(jī)重新組合，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，給出細(xì)胞內(nèi)各部 分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)線度。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi) 生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細(xì)胞形態(tài)的定量。用途類似熒光顯微鏡，

9、 但能掃描不同層次，形成立體圖像。優(yōu)點是排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖 像反差和提咼分辨率（1.41.7），可重構(gòu)樣品的二維結(jié)構(gòu)。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)（五）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET 技術(shù)是檢測活體中生物大分了納米距離和納米距離變化的有力工具，可用于檢 測某一細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。FRET 現(xiàn)象：當(dāng)供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團(tuán)分子的吸收光譜重疊， 并且兩個探針的距離在 10nm 以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，稱 FRET 現(xiàn)象。采用融合表達(dá)方式，可將兩個蛋白的距離拉近于 510nmFRET 效率反映了被檢的兩種蛋白是否直接作用及作用的強(qiáng)弱。（六）熒光漂白恢復(fù)技術(shù)又稱光脫色

10、恢復(fù)技術(shù)，可用于檢測活體細(xì)胞表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn) 動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬 滅，光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)可通過非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或胞質(zhì)中運(yùn)動 至光漂白區(qū)來完成。用于檢測活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài) 變化率的大小四、電子顯微鏡技術(shù)用于研究細(xì)胞內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)。（一）、電子顯微鏡的基本知識1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM200200nmnm可見光玻璃透不要求真空利用樣品對TEMTEM100100 nmnm(400-700400-700 )鏡不要求真空

11、光的吸收形0.10.1 nmnm紫外光玻璃透要求真空成明暗反差(約 200200nm)nm)鏡51.33x101.33x10-和顏色變化電子束電磁透1.33x101.33x10-3PaPa利用樣品對(0.01-0.90.01-0.9 ) 鏡電子的散射和透射形成明暗反差教學(xué)內(nèi)容小結(jié)2、電子顯微鏡的特征以電子束作光源，電磁場作透鏡。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等4 部分構(gòu)成；分辨力 0.2nm,放大倍數(shù)可達(dá) 106;用于觀察超微結(jié)構(gòu)(小于 0.2 卩 m)(二)主要電鏡制備技術(shù)1、超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋， 以熱膨脹或螺

12、旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度20-50nm=由于電子束的穿透能力有限，為獲得高分辨率的圖像，切片厚度一般僅為40-50nm,即一個直徑為 20um 的細(xì)胞可以切成幾百片，故稱超薄切片。這需要 樣品具備一定的剛性和韌性，而生物樣品不具備這些特性，因此需要包埋于特 殊的介質(zhì)中，包埋時會破壞樣品的結(jié)構(gòu)，因此在包埋前必須先將樣品固定。(1) 固定：保持樣品的真實性，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分保持在原來位置上通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，低溫，防止酶的自溶而破壞樣品結(jié)構(gòu)。(2)包埋： 各種細(xì)微結(jié)構(gòu)在切片過程中獲得均勻良好的支撐，使獲得的超薄切 片連續(xù)完整并有足夠的強(qiáng)度，且能耐受觀察時的電子轟擊、高溫和真空揮

13、發(fā)。 常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂。注意：生物樣品固定后仍含有大量水分，而包埋劑是與誰不相溶的，因此在包埋前通常需要一系列的脫水處理。(3) 切片：通過樣品桿的金屬熱膨脹或機(jī)械伸縮控制切片厚度。切片刀：玻璃或磚石。切片需撈在覆有支撐膜的載網(wǎng)上才能在電鏡下觀察。(4) 染色：用重金屬鹽染色以形成明暗反差，只能觀察到黑白圖像不同的成分對不同的燃料有不同的親和性：鋨酸一脂質(zhì)；鉛鹽一蛋白質(zhì)；醋酸 鈾一核酸。2、負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金 屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，襯托出樣品的精細(xì)結(jié) 構(gòu)，分辨力可達(dá) 1.5 nm 左右。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)3、冰

14、凍蝕刻 freeze-etching亦稱冰凍斷裂蝕刻復(fù)型。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后, 冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑 和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica ）。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞 斷裂面處的結(jié)構(gòu)。用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜面結(jié)構(gòu)，立體感，不需要包埋、固定 深度蝕刻主要用來觀察胞質(zhì)中細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。4、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)將電子顯微鏡、 電子衍射、 計算機(jī)圖像處理相結(jié)合的技術(shù)。 用于分析難形 成晶體的膜蛋白、病毒和蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。生物樣品的二維晶體在不同傾角下進(jìn)

15、行拍照，得到一系列電鏡圖片，傅里 葉變換處理，得到三維結(jié)構(gòu)電子密度圖展示生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，具有高分辨率5、掃描電鏡技術(shù)（SEM掃描電子顯微鏡于 20 世紀(jì) 60 年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。工作 原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子 的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探 測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)?電信號來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像 為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一

16、層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次 級電子信號。CO 2 臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。五、掃描隧道顯微鏡（STM它于 1981 年由格爾德賓寧（Gerd K.Binnig）及亨利希羅勒 （Heinrich Rohrer） 在 IBM位于瑞士蘇黎世的蘇黎世實驗室發(fā)明掃描隧道顯微鏡，只一種在納米水平上探測微觀世界物質(zhì)表面形貌的一儀器。原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時， 即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在教學(xué)內(nèi)容小結(jié)計算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。主要裝置.? XYZ 方向掃描的

17、壓電陶瓷、?逼近裝置、?電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)、?數(shù)據(jù)采集、處理和顯示系統(tǒng)主要特點：?具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)：側(cè)分辨率0.1-0.2nm，縱分辯率 0.001 nm?真空、大氣、液體條件下工作?非破壞性測量局限性：?掃描隧道顯微鏡(STM)所觀察的樣品必須具有一定程度的 導(dǎo)電性，對于半導(dǎo)體，觀測的效果就差于導(dǎo)體；對于絕緣體則根本無法直接觀察。?在掃描隧道顯微鏡(STM)的恒電流工作模式下，有時它對樣品表面微粒之間的某些溝槽不能夠準(zhǔn)確探測，與此相關(guān)的分辨率較差。第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞成分的分析相結(jié)合是當(dāng)代細(xì)胞生物學(xué)研究中長采用的試驗方法。一、細(xì)胞組分分離技術(shù)?是分離細(xì)胞器及各種大

18、分子基本手段。?轉(zhuǎn)速 1025kr/min 的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。?轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89Kg 者稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá) 100000r/min，離心力超過 500kg。（一）差速離心 Differential centrifugation?特點：?介質(zhì)密度均一；?速度由低向高，逐級離心。?用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)?沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與咼基體核蛋白體。?可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。（二）密度梯度離心?用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻 漿置于介質(zhì)的頂部，通

19、過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。?類型：速度沉降、等密度沉降。?常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。?分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：? 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；? 2） PH 中性或易調(diào)為中性；? 3）濃度大時滲透壓不大； ? 4）對細(xì)胞無毒。1. 速度沉降 velocity sedimentation?用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。?特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密 度。?原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降 而達(dá)到分離。2. 等密度沉降 isopycnic sedimentation?用途：分離密度不

20、等的顆粒。?特點：?介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。?力場比速率沉降法大 10100 倍，需要咼速或超速離心。?原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與 自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成 分分離。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)、細(xì)胞內(nèi)生物大分子的顯示方法:原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含 量。DNA 福爾根（Feulgen）反應(yīng)- 紫紅色多糖類：PAS 反應(yīng)黃色脂肪：蘇丹 III 紅色蛋白質(zhì)：米倫（Millon ）紅色1、 金屬沉淀法：

21、如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS 或 PbS 有色沉淀，而顯示出酶活性。2、Feulgen 反應(yīng)：醛基可使 Schiff 試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖 和脫氧核糖核酸3、 四氧化鋨：與不飽和脂肪酸反應(yīng)成黑色，脂肪滴4、Millon （米倫）反應(yīng)：氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的絡(luò)氨酸殘基反應(yīng)，形成紅色沉淀，（有色復(fù)合物）蛋白質(zhì)5、聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解 H202 產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化 成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。6、脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。7、茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)三、特異蛋白抗原的定位與定性細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位法：免疫熒光技術(shù)和免疫

22、電鏡技術(shù)蛋白質(zhì)體外定性法：免疫印跡、放射免疫沉淀、蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜分析（一）免疫熒光技術(shù)根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，并標(biāo)上標(biāo)記熒光素，對 抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)?？焖?、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。（二）免疫電鏡技術(shù)能有效提高樣品的分辨率，在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位。免疫鐵蛋白技術(shù)教學(xué)內(nèi)容小結(jié)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位和定性分子雜交技術(shù)：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成 DNA-DNA DNA-

23、RNA 或 RNA-RN 雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。?原位雜交(in situhybridization)。用于檢測染色體上的特殊 DNA 序列。最初是使用放射性 DNA 探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動態(tài)?用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。?原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位和半定量研究的一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。? 一般用14C 和

24、3H 標(biāo)記。常用 3H-TDR 來顯示 DNA 用 3H-UDR!示 RNA 用3H 氨基酸研究蛋白質(zhì)，用 3H 甘露糖、3H 巖藻糖研究多糖。?14C 半衰期為 5730 年，3H 為 12.5 年。六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)1、流式細(xì)胞儀?用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。?可定量地測定某一細(xì)胞中的 DNA RNA 或某一特異蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞的數(shù)量。特別是它還可將某一特異染色的細(xì)胞從數(shù)以萬計的細(xì)胞群體中分離出來，以及將DNA 含量不同的中期染色體，甚至 X 或丫染色體的精子分離出來。?原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)

25、胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢教學(xué)內(nèi)容小結(jié)J測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá) 99%包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞儀(flow cytometer )。2、顯微分光光度測定技術(shù)?實質(zhì)上是顯微鏡技術(shù)和分光光度技術(shù)的結(jié)合。它以物質(zhì)分子的光吸收、熒光發(fā)射和光反射特性作為測量基礎(chǔ)，可以對細(xì)胞內(nèi)的某些重要的生物分子(如 DNA RNA 蛋白質(zhì)等)的含量進(jìn)行定量測試，是組織化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中定量研究的必不可少的工具。?顯微吸收光度法時一種光度測量的化學(xué)方法，它基于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、多糖、核酸、

26、脂類和酶染顆粒能在不同等電點下電離出不同側(cè)基，因而造成對染料親和力不同，應(yīng)用不同的化學(xué)試劑染色，可使不同的細(xì)胞組分染上不同的顏色，在顯微鏡下成為可見的結(jié)構(gòu)。染料于組分的結(jié)合必須是特異性的，即染料、細(xì)胞組分結(jié)合物的光吸收是遵循朗伯-比爾定律，而且染色深淺與被染細(xì)胞組分之間呈化學(xué)劑量學(xué)關(guān)系，符合這兩者關(guān)系的樣本就可應(yīng)用吸收測量法，通過光檢測器(可使光能變成電能)測量有色化合物吸收單色光的量。第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)就是將動植物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個細(xì)胞或直接以單細(xì)胞 生物，給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與增殖。(一)、動物細(xì)胞培養(yǎng)?

27、原代培養(yǎng)(primary culture cell ):從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。?傳代培養(yǎng)(subculture cell ):適應(yīng)在培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。?細(xì)胞系(cell line )：通過純系化或選擇法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來的細(xì)胞群體。?細(xì)胞株（cell strain ）:從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特疋性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)細(xì)胞貼壁：分散的細(xì)胞懸液在培養(yǎng)瓶中很快（幾十分鐘貨數(shù)小時內(nèi)）就貼附于瓶壁上的現(xiàn)象。（二）、植物細(xì)胞培養(yǎng)1.原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點：?比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如 DNA?便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；?適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)

28、誘導(dǎo)分化成完整植株。2.單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。（三）、非細(xì)胞體系來源于細(xì)胞，而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但包含了進(jìn)行正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系即為非細(xì)胞體系（cell-freesystem）。用途：研究 DNA 復(fù)制、RNA 專錄、蛋白質(zhì)合成、高爾基體的膜泡運(yùn)輸機(jī)制以及細(xì)胞核裝配等。二、細(xì)胞工程（一）細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交技術(shù)通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cell fusion）或細(xì)胞雜交。?同核融合細(xì)胞：基因型相同的細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞。?異核融合細(xì)胞：基因型不同的細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞。?自

29、發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。?誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。在自然界中細(xì)胞自發(fā)融合發(fā)生的機(jī)率很小，一般需要誘發(fā)融合。誘發(fā)融合細(xì)胞的方法一般有以下幾種：誘發(fā)細(xì)胞融合的方法：1 生物法：病毒促進(jìn)細(xì)胞融合，其中仙臺病毒(HVJ 是最早用于動物細(xì) 胞融合的融合劑。原理：病毒被膜具有凝聚細(xì)胞的能力，它一邊黏連一個細(xì)胞 的表面，另一邊黏連另一個細(xì)胞的表面，從而使兩個細(xì)胞在病毒的作用下靠近 發(fā)生凝結(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞的融合。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)2、化學(xué)法：主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇(PEG、二甲亞砜(DMSO 甘油-醋酸酯、油酸鹽、脂質(zhì)、Ca2+配合物等。其中聚乙二醇法是較常用的化學(xué)融合方法。其原理是 PEG 分子具有輕微的 負(fù)極性，與具有正極性基團(tuán)的物質(zhì)形成氫鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使 原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合。3、物理法：電融合法。其 原理是改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而 質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。細(xì)胞融合的步驟1、動物細(xì)胞的融合(1)細(xì)胞準(zhǔn)備。分貼壁和懸浮細(xì)胞兩種。前者可直接將兩親本細(xì)胞混合 培養(yǎng)，后者需制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液。(2)細(xì)胞融合，加促融因子于將行融合的細(xì)胞之中，誘導(dǎo)融合。(3)雜種細(xì)胞選擇。利用選擇性培養(yǎng)基等，使