抑制Ras 信號通路可減弱小鼠胚胎干細胞的造血分化

1、抑制Ras 信號通路可減弱小鼠胚胎干細胞的造血分化    作者：王曉燕劉兵要暉宇侯寧楊曉于曉?毛寧    【摘要】 為了探討Ras信號通路對小鼠胚胎干細胞(Embryonic Stem cells, ES cells)造血分化的影響，將突變型基因RasN17轉染小鼠ES細胞，免疫印跡檢測RasN17的表達對Erk1/2及Akt磷酸化的作用，應用半定量RT?PCR檢測ES細胞在分化過程中與造血相關的基因的表達。結果表明：Ras N17的表達能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，攜帶RasN17基因的ES細胞在分化過程中

2、Runx1 、SCL 及beta?major珠蛋白等基因的表達被顯著抑制， 而FLK1的表達不受影響。結論：ES細胞體外造血分化需要Ras通路的活化。    【關鍵詞】 胚胎干細胞； 造血分化； Ras Suppression of Ras Mediated Signaling Attenuates Hematopoietic Diffe?rentiation of Embryonic Stem Cells of Mice In Vitro    Abstract    To

3、 investigate the possible involvement of Ras signaling in the hematopoietic differentiation of embryonic stem cells (ES cells), ES cells were transfected with RasN17, the dominant?negative mutant of Ras. Western blot was used to test the effect of RasN17 expression on Erk1/2 and Akt phosphorylation,

4、 semi?quantitative RT?PCR was used to detect expression of gene related to hemalopoiesis in differentiation of ES cells. The results showed that the expression of RasN17 in the ES cells remarkably downregulated the phosphorylation of Erk1/2 and Akt simultaneously. Moreover, the expression of several

5、 markers related with hematopoiesis including Runx1, SCL and beta?major globin， were significantly suppressed in the EB expressing RasN17, whereas the transcription of Flk1, a gene required earlier than SCL in development of hematopoietic and endothelial lineages, was not influenced. It is concluded

6、 that the activation of Ras is pivotal for in vitro hematopoietic differentiation of ES cells.    Key words    embryonic stem cell; hematopoiesis differentiation; Ras    Ras是由1條多肽鏈組成的低分子量蛋白，由原癌基因ras編碼而命名，包括K?，N?，H? 3種類型。Ras的活性取決于其與GTP及GDP的結

7、合，與前者的結合是其活化形式。 它是MAPK(Erk1/2)及PI3K等信號通路上游的重要組成成分，并通過參與調控這些信號通路而影響細胞的增殖與分化。最近研究發(fā)現，Ras及其下游信號分子均參與調控小鼠的胚胎發(fā)育，并且不同類型的Ras對胚胎發(fā)育特別是造血發(fā)育發(fā)揮不同的調控作用1。胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES cell)是一種具有全能分化特性的細胞，其體外造血分化可以模擬并重現體內胚胎造血過程。報道表明：Ras及其下游的信號通路對ES細胞體外培養(yǎng)過程中全能性的維持非常重要2。但Ras蛋白能否調控小鼠ES細胞體外造血分化并不明確。為此，本研究探討了Ras信號通路阻斷對E

8、S細胞造血分化的影響。    材料和方法    材料    DMEM、IMDM、胎牛血清、L?谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均為Hyclone公司產品。硫代甘油（MTG）為Sigma公司產品。丙酮酸鈉、無蛋白雜交瘤培養(yǎng)液（PFHM ）購自Gibco?BRL公司。小鼠白血病抑制因子（mLIF）購自Chemicon公司。小鼠干細胞因子（SCF）為PeprotTech公司產品。小鼠將CCE細胞接種于Co60照射后的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上，于5% CO2、飽和濕度、37條件

9、下進行維持培養(yǎng)。維持培養(yǎng)體系組成為：DMEM 含15%胎牛血清、2 mmol/L L?谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 mol/L MTG 及mLIF 1 000 U/ml。在造血分化培養(yǎng)前48小時將細胞傳代于預分化培養(yǎng)體系，即將維持培養(yǎng)體系內DMEM更換為IMDM，其他成分不變。預分化培養(yǎng)48小時后按常規(guī)傳代收集細胞并計數，細胞按2×103接種于直徑35 mm的Petri dish，培養(yǎng)體系為：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纖維素、2 mmol/L L?谷氨酰胺、150 mol/L MTG、1 mmol/L的丙酮酸鈉、2 mmol/L PFHM、50 n

10、g/ml的SCF，培養(yǎng)條件同維持培養(yǎng)。    ES細胞的pCMV?RasN17及 pCMV質粒轉染    質粒pCMV?RasN17購自Clontech公司，pCMV質?？蛰d體為本室構建并鑒定。傳代貼壁培養(yǎng)12小時的ES細胞應用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司產品)按說明書進行轉染。24小時后傳代于含neo基因的MEF（neo?MEF）之上，并同時加800 g/ml的G418篩選陽性克隆。 7 天后挑取不同細胞克隆擴增后鑒定外源基因的表達。   

11、0;相關基因的RT?PCR檢測    TRIzoL（Sigma公司產品）提取細胞總RNA，按AMV及Ex Taq試劑盒 (TaKaRa)說明書進行半定量RT?PCR以檢測相關基因的表達，即每份樣本分別取0.02 g（0.01×），0.2 g（0.1×），2 g（1×）RNA進行逆轉錄反應，然后取1 l的cDNA進行30循環(huán)的PCR。引物序列、退火溫度及所擴增基因片段長度見附表。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描電泳條帶。    Western blot 

12、60;  ES細胞用0.25%胰蛋白酶消化后離心洗滌，應用維持培養(yǎng)體系貼壁再培養(yǎng)45分鐘后收集懸浮細胞并用PBS洗滌； EB按上述分化方法培養(yǎng)并收集。以上樣品加入細胞裂解液（Bio?Rad）置冰上反復吹打裂解，煮沸5-10分鐘，10 000×g，4離心10分鐘，取上清，應用Pierce公司試劑盒(BCATM Protein Assay Kit)測蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂牛奶，0.1% tween?20的TBS（TBST）封閉1小時， 用TBST洗膜，5分鐘，共3次。之后分別按說明書用一抗、二抗（Cell Sig

13、naling）孵育帶有目的蛋白的硝酸纖維素膜。按檢測試劑盒（Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce）說明書檢測目的蛋白。    結    果    ES細胞分化過程中Ras下游的MAPK和PI3K通路發(fā)生活化    收取ES細胞及分化不同時間的EB進行Western blot的檢測，結果如圖1所示。ES細胞內MAPK通路的Erk1/2及PI3K下游的Akt處于高

14、水平磷酸化狀態(tài)，可能是由于維持培養(yǎng)過程中加入的LIF可以激活這兩條通路所致3。而分化第6天的EB內Erk1/2及Akt的磷酸化水平同前一時間點相比有顯著升高。與此相對應，永久造血分化在第6天時發(fā)生。以上結果提示，作為上游信號的Ras可能通過活化這兩條通路參與調控ES細胞的造血分化。    Figure 1. Activation of Erk1/2 and Akt during EB differentiation. ES and EB cells harvested at the indicated time points were subjected

15、 to Western blot.    RasN17在ES細胞內的表達下調MAPK(Erk1/2)及Akt的磷酸化水平    RasN17屬于H?Ras，其第17位的Ser被突變成Asp，它的表達可使細胞內源性Ras失活，從而阻斷Ras參與的信號通路的活化，起到與基因敲除類似的效應。應用Lipofectamine2000將質粒pCMV?RasN17及pCMV轉染CCE，經G418篩選后Neo基因的表達及Ras蛋白表達量的上調標志轉染成功(圖2A、 B)。Nanog和Oct4的表達是ES細胞處于未分化狀態(tài)的兩個重要

16、標志，這兩個基因的表達說明RasN17不影響ES細胞的維持培養(yǎng)(圖2A)。ES細胞的克隆形態(tài)也不受RasN17的影響(圖3A，D，G)，ALP是ES細胞處于未分化狀態(tài)的另外一個標志，它的表達同樣說明RasN17不影響ES細胞的維持培養(yǎng)（圖3B，E，H）。如圖2B所示，轉染RasN17后ES細胞內Erk1/2 及Akt的磷酸化水平同時降低，說明其能夠同時抑制MAPK及PI3K兩條通路的活化。    RasN17表達下調ES細胞分化過程中造血相關基因的表達水平    提取分化7天的EB細胞總RNA進行半定量RT?PCR

17、，結果顯示：轉染RasN17的ES細胞在形成的EB的分化過程中，Runx1、scl基因、beta?major珠蛋白的表達下調(圖4)， 而Flk?1的表達沒有明顯變化?？梢姡琑asN17可以下調ES細胞造血分化過程中某些相關轉錄因子及分化標記的表達，提示Ras通路的活化為ES細胞正常造血分化所必需。    討    論    Ras下游信號通路包括MAPK（Erk1/2）及PI3K通路等。Ras活化后可以通過激活其下游不同的信號通路來調節(jié)ES細胞自我更新與分化2。Erk1/2

18、的活化促進小鼠ES細胞的分化并且是ES細胞分化所必需的2，當Erk1/2的活化被阻斷后，小鼠ES細胞在體外分化過程中不能形成中胚層及胚外內胚層，則ES細胞不能形成正常的EB4,5。PI3K通路的活化不僅為ES細胞體外培養(yǎng)過程中全能性的維持所必需3，同時也是ES細胞正常分化所必需的。例如， bFGF激活的PI3K通路參與ES細胞向EB分化過程中中胚層的形成6。此外，PI3K通路的活化參與調控小鼠胚胎發(fā)育過程中的永久造血分化，當將該通路上游的p85基因敲除后，小鼠胎肝紅系造血發(fā)生缺陷7。由此可見，Ras可通過調控多條信號通路來影響ES細胞體外正常分化及小鼠胚胎的正常發(fā)育。  &

19、#160; ES細胞體外可以分化產生各系造血細胞，其造血分化過程可以模擬并重現小鼠胚胎造血發(fā)育。ES細胞造血分化過程伴隨諸多造血相關轉錄因子及蛋白的表達，這些因子的表達既可作為造血分化的標志同時又是正常造血分化所必需的。其中，Runx1是一種與DNA結合的轉錄因子，其表達是小鼠胚胎造血發(fā)育過程中永久造血開始的標志之一。runx1-/-小鼠胚胎的永久造血缺失8；runx1基因的丟失同樣可以阻斷ES細胞體外分化過程中永久造血細胞的產生8,9。scl（stem cell leukemia）基因在小鼠胚胎發(fā)育過程中為中胚層向造血細胞分化所必需。該基因缺失可導致胚胎由于造血分化異常而死亡，sc

20、l 基因缺失后ES細胞不能進行造血分化10。beta?major 珠蛋白是永久紅細胞的標志。Flk?1是VEGF的受體之一，在小鼠胚胎發(fā)育早期的中胚層細胞開始表達，其缺失導致胚胎發(fā)育過程中卵黃囊血島不能形成，同時血管系統(tǒng)的發(fā)育出現異常11。我們的結果顯示，RasN17可以下調ES細胞造血分化過程中Runx1、 scl及beta?major珠蛋白的表達，這表明Ras通路的活化是ES細胞造血分化所必需的。    與以往報道RasN17只阻斷Erk1/2通路5不同，本研究中轉染RasN17的ES細胞內Erk1/2及Akt磷酸化水平同時降低的結果表明：RasN1

21、7可能通過同時阻斷MAPK(Erk1/2)和PI3K兩條通路的活化影響ES細胞的造血分化。    本研究中，RasN17可能通過以下機制下調EB細胞內造血標志的表達：第一，使ES細胞不能形成正常的EB，則造血分化缺乏合適的微環(huán)境而發(fā)生缺陷；第二，MAPK(Erk1/2)和Akt信號通路的抑制直接影響造血細胞的產生；第三，以上兩種機制同時存在。然而，RasN17抑制ES細胞造血分化的具體機制有待進一步明確。 【參考文獻】 1Johnson L, Greenbaum D, Cichowski K, et al. K?ras is an essential g

22、ene in the mouse with partial functional overlap with N?ras. Genes Dev, 1997;11:2468-24812王曉燕，劉兵，毛寧. 小鼠胚胎干細胞自我更新的信號調控機制. 中國實驗血液學雜志, 2006;14:1248-12523Paling NR, Wheadon H, Bone HK, et al. Regulation of embryo? nic stem cell self?renewal by phosphoinostide 3?kinase dependent signaling. J Biol Chem, 2

23、004; 279: 48063-480704Yao Y, Li W, Wu J, et al. Extracellular signal?regulated kinase 2 is necessary for mesoderm differentiation. Proc Nati Acad Sci USA, 2003;100: 12759-127645Yoshida?Koide U, Matsuda T, Saikawa K, et al. Involvement of Ras in extraembryonic endoderm differentiaion of embryonic ste

24、m cells. Biochem Biophys Res Commun, 2004;313:475-4816Chen Y, Li X, Eswarakumar VP, et al. Fibroblast growth factor (FGF) signaling through PI 3?kinase and Akt/PKB is required for embryoid body differentiation. Oncogene, 2000; 19:3750-37567Huddleston H, Tan B, Yang FC, et al. Functional p85 gene is required for normal murine fetal liver eryth