雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究

1、化學(xué)與生物工程Chemistry &Bioengineering2006,Vol. 23No. 107雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究鄭楠, 劉杰(南昌大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 江西南昌330029摘要:闡述了雙水相萃取原理, 詳細分析了影響雙水相萃取分離純化蛋白質(zhì)的各種因素, 探討了雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用并對其前景進行了展望。關(guān)鍵詞:雙水相; 蛋白質(zhì); 分離純化; 影響因素中圖分類號:TQ 02818Q 512+11文獻標識碼:A文章編號:1672-5425(2006 10-0007-03液-液萃取技術(shù)是化學(xué)工業(yè)中普遍采用的分離技術(shù)之一, 在生物化工中也有廣泛的應(yīng)用

2、。然而, 大部分生物物質(zhì)是有生物活性的, 需要在低溫或室溫條件下進行分離純化, 而采用傳統(tǒng)萃取技術(shù)無法完成。雙水相萃取就是考慮到這種現(xiàn)狀, 基于液-技術(shù)。與傳統(tǒng)的液-, :體系含水量高, 可達80%以上; 蛋白質(zhì)在其中不易變性; 界面張力遠遠低于于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等 , 使其在上、下相中的濃度不同K , (01110之間 , 因2雙水相萃取中影響蛋白質(zhì)分配的因素211聚合物的分子量同一類聚合物的疏水性隨分子量的增大而增強1, 當聚合物的分子量減小時, 蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。如在PEG 2Dext ran 系統(tǒng)中,PEG 的分子量減小或Dextran

3、的分子量增大都會使分配系數(shù)變大, 相反PEG 的分子量增大或Dext ran 的分子量減小會使分配系數(shù)變小。這是由于PEG 分子量增大時, 它的疏水性顯著增強, 使蛋白質(zhì)在上相的表面張力增大, 從而易于向下相分配。同理,Dext ran 的疏水性隨其分子量的增大而增強, 使蛋白質(zhì)在下相的表面張力增大, 從而不斷向上相分配。212聚合物的濃度水-有機溶劑兩相體系的界面張力, 有助于強化相際間的質(zhì)量傳遞; 分相時間短, 一般只需515min ; 易于放大和進行連續(xù)性操作; 萃取環(huán)境溫和, 生物相容性高; 聚合物對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護作用等。正是由于雙水相萃取技術(shù)的諸多優(yōu)勢, 現(xiàn)已被廣泛用于蛋白

4、質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、細胞器等產(chǎn)品的分離和純化。1雙水相萃取原理雙水相體系是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間, 在水中以適當?shù)臐舛热芙夂笮纬傻幕ゲ幌嗳艿膬上嗷蚨嘞嗨囿w系。高聚物-高聚物-水體系主要依靠高聚物之間的不容性, 即高聚物分子的空間阻礙作用, 促使其分相; 高聚物-鹽-水體系一般認為是鹽析作用的結(jié)果。雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似, 都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配, 不同之處在于萃取體系的性質(zhì)差異。當生物物質(zhì)進入雙水相體系后, 由收稿日期:2006-04-17在雙水相系統(tǒng)中, 界面張力很低并且隨結(jié)線長度呈指數(shù)規(guī)律的增大。當系統(tǒng)組成處于臨界點時, 系線長度為零, 上下相組

5、成相同, 蛋白質(zhì)均勻地分配在兩相中, 分配系數(shù)K =1。當成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增加時, 系統(tǒng)遠離臨界點, 系線長度增大, 兩相性質(zhì)的差別也增大, 同時蛋白質(zhì)在兩相中的界面張力差別增大, 使其趨于向一側(cè)分配, 即K 值或增大超過1, 或減小低于1。作者簡介:鄭楠(1982- , 女, 陜西人, 碩士研究生, 主要從事生化制藥方面的研究。E 2mail :zhengnan1982 。8213添加劑21311中性鹽鄭楠等:雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究/2006年第10期214pH 值鹽的種類對分配系數(shù)的影響主要反映在對相間電位的影響上2。中性鹽的種類不同, 其正負離子分

6、配系數(shù)也不同, 當它在雙水相中電離時, 為保持兩相的電中性, 產(chǎn)生了不同的相間電位, 從而影響蛋白質(zhì)的分配。如在PEG 2Dext ran 體系中加入NaClO 4或KI , 可增加上相對帶正電的蛋白質(zhì)的親和效應(yīng), 并迫使帶負電的蛋白質(zhì)進入下相; 若加入Li 3PO 4情況則相反1。故只要改變界面電勢就可控制荷電蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入所需要的相中。鹽的濃度對分配系數(shù)的影響主要反映在對蛋白質(zhì)疏水性的影響上2。如Uf uk Gunduz 和K o nca K orkmaz 用PEG33502Dextran35000體系分配BSA 時, 保持體系NaCl 濃度不等(0106mol L -1、011mol L -

7、1、012mol L -1、013mol L -1、0134mol L -1 , 發(fā)現(xiàn)在任一p H 值下, 隨著NaCl 濃體系p H 值會影響蛋白質(zhì)分子可離解基團的離解度, 從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配。同時-p H 值還會影響緩沖離子如HPO 2、PO 344等的分配, 以改變相間電位來達到改變分配系數(shù)的目的。另外在研究分配系數(shù)與p H 值的關(guān)系時, 若加入不同種類的中性鹽, 由于電位差的不同, 其相應(yīng)關(guān)系也不同1。215溫度溫度的變化影響相物理性質(zhì)的變化, 例如粘度和密度等, 從而影響蛋白質(zhì)的分配7。但總的來說, 溫度對分配系數(shù)的影響是通過對相圖的影響來間接達到的。在臨界點附近,

8、 溫度對相圖的影響最顯著, 對分配系數(shù)的影響最強。當遠離臨界點時, 溫度對相圖的影響較小, 分配系數(shù)對溫度的變化也不敏感。這是由于遠離臨界點時, , 對蛋白質(zhì)的穩(wěn)。2, 或葡聚糖上引入帶電基團來改變蛋白質(zhì)的分配。因相間電位差與電荷數(shù)成反比, 而每個葡聚糖分子上可引入的帶電基團較多, 故效果較差。相反, 每個PEG 分子只含兩個羥基, 只需引入兩個荷電基團, 電場增大的效果就較好。Johansson 等已制得以下四種荷電PEG:帶正電的三甲胺基2PEG (TMA 2PEG 、氨基2PEG (PEG 2N H 2 和帶負電的PEG 2磺酸鹽(S 2PEG 、羧基2PEG (PEG 2COO H 8

9、。因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電情況來選擇荷電PEG , 以達到改變蛋白質(zhì)分配的目的。如紅血球蛋白在p H 值較小時帶正電(等電點為7 , 若將PEG 接上三甲胺基基團后, 由于上相帶正電, 紅血球蛋白就不斷向下相富集; 同理, 當p H 值較大時, 由于受上相正電TMA 2PEG 的影響, 帶負電荷的紅血球蛋白則開始向上相富集。217疏水基團在聚合物上接枝疏水基團后, 疏水性成為影響蛋白質(zhì)分配的主要因素。這種疏水性的影響由連接在高聚物上疏水基的大小和蛋白質(zhì)分子疏水區(qū)域的數(shù)量以及疏水區(qū)的粘結(jié)強度所決定。Shanbhag 和Axelsson 認為, 通過比較蛋白質(zhì)在PEG 2Dext ran 體系和存

10、在部分P 2PEG (Palmitoyl 2PEG 的PEG 2Dextran 體系中的分配系數(shù), 可以衡量蛋白質(zhì)的疏水性。實驗表明, 在P 2PEG 濃度很低的情況下, 血清白蛋白和乳球蛋白因度的增加, 分配系數(shù)先減小后增大, 且在012mol L -1處達到最小。這是由于BSA 水性隨NaCl 當濃度為012mol L -BSA 也就最多, 3。21312有機溶劑在雙水相體系中添加少量有機共溶劑, 使得體系中的一部分水被有機共溶劑所取代, 導(dǎo)致兩相界面處的疏水性能差異發(fā)生變化, 同時界面張力以及電位差也隨之改變, 從而影響了蛋白質(zhì)的分配4。通常認為, 有機共溶劑對被分配物質(zhì)分配行為的影響更

11、主要是有機溶劑和成相高聚物相互作用的結(jié)果5。如在PEG40002Dextran40000體系中分別加入相同量(2% 的乙醇、異丙醇、丙酮, 均使BSA 的分配系數(shù)顯著降低, 且加入乙醇后分配系數(shù)達到最小。這一現(xiàn)象完全符合以上理論:由于乙醇有較大的水化能, 體系中的水較多地被乙醇所取代, 使兩相界面處的疏水性能差異、界面張力以及電位差較其它有機溶劑大, 因此蛋白質(zhì)分配系數(shù)的變化較大; 再者乙醇與PEG 相相互作用較強, 使得蛋白質(zhì)受排斥而易于向Dext ran 相富集。21313表面活性劑Bodhankar 和Gaikar 等研究了四類表面活性劑, 即陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、非離子表

12、面活性劑和兩性表面活性劑在PEG 2Dext ran 體系中對物質(zhì)分配的影響。實驗表明, 添加表面活性劑可以改變界面張力、上下相組成等兩相特性, 從而對物質(zhì)的分配行為進行調(diào)節(jié)6。易于同非極性的P 2PEG 結(jié)合, 所以不斷向上相富集8。218親和配基鄭楠等:雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究/2006年第10期9(3 金屬親和雙水相萃取技術(shù)。金屬親和雙水相在聚合物上接上一定的親和配基, 不僅能提高萃取分配的專一性, 而且能增大處理量。例如:NAD H 2PEG 衍生物引入PEG 2Dext ran 體系后使乙醇脫氫酶的分配系數(shù)與其分子上結(jié)合位點數(shù)密切相關(guān); 另Ciba 2cronblue 2P

13、EG 衍生物引入PEG 2Dext ran 體系后使磷萃取和普通親和雙水相萃取相比, 具有親和配基價廉且再生容易、可用于PEG 2鹽體系的優(yōu)點。Arnold 提出了金屬離子親和雙水相萃取技術(shù), 利用金屬離子和蛋白質(zhì)中精氨酸、組氨酸的親和作用, 以達到分離純化蛋白質(zhì)的目的。目前金屬離子親和雙水相萃取已應(yīng)用于多種酶的分離純化。影響雙水相萃取的因素比較復(fù)雜, 主要包括靜電作用、疏水作用及界面張力等。通過對各個因素的調(diào)節(jié), 可以極大地提高蛋白質(zhì)的選擇性, 達到向一相富集的目的。參考文獻:1曹軍衛(wèi), 馬輝文. 微生物工程M .北京:科學(xué)出版社,2002:2352237.2孫彥. 生物分離工程M .北京:

14、化學(xué)工業(yè)出版社,1998:64.3Gunduz Ufuk , K orkmaz K Bovine serum albumin partitioningin aqueous :Effect of p H and sodium chloride B :BiomedSci Appl , (1+2258.4B Y , Borovskaya A A , Gulaeva N D ,et al. Physico 2chemical features of solvent media in t he phases of aqueous poly 2mer two 2phase systemsJ.Biotech

15、nol Bioeng ,1992,40(1 :127. 5Johansson G , K opperschlager G. Effect s of organic solvent s ont he partitioning of enzymes in aqueous two 2phase systems J .Journal of Chromatography A ,1987,388:2952305.6朱建航. 新型反應(yīng)體系中生物催化合成頭孢氨芐的研究D .上酸果糖激酶的分配系數(shù)成千倍地提高。也可同時使用以上兩種配基, 從而增加系統(tǒng)的選擇性, 完成多種酶的分離和回收7。3雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)

16、分離純化中的應(yīng)用和展望雙水相萃取技術(shù)已成功地用于分離和提純蛋白質(zhì)、提取抗生素和分離生物粒子、電泳分離氨基酸等方面。雙水相萃取分離技術(shù)還有很多可開拓的領(lǐng)域:(1 新型雙水相體系的開發(fā)。新型雙水相體系主要有兩類:廉價高聚物/高聚物體系及新型功能雙水相體系。廉價雙水相體系的開發(fā)目前主要集中在尋找一些廉價的高聚物取代現(xiàn)用昂貴的高聚物。例如:PP T 的變性淀粉和牌號為Reppa/以及牌號為Pulluan 2Dext ran 形成的雙水相體系常相似, 其穩(wěn)定性也比PEG 2鹽雙水相體系更好, 并且具有蛋白質(zhì)溶解度大、粘度小等優(yōu)點10。另外, 特別要提到只有一種成相聚合物的新的雙水相體系, 上相幾乎100

17、%是水, 聚合物絕大部分集中在下相, 該體系不僅操作成本低、萃取效果好, 還為蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)提供了更溫和的環(huán)境11。(2 后續(xù)色譜純化工藝研究。高聚物/高聚物雙水相萃取同離子交換層析技術(shù)結(jié)合可以解決雙水相萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)粗分離純化中的工業(yè)化問題。PEG 2鹽體系具有價廉和分相容易的優(yōu)點, 而疏水色譜可在高鹽濃度下操作, 故PEG 2鹽體系與疏水色譜的結(jié)合有很大的發(fā)展空間。如Schutte 已成功利用疏水色譜從鹽相中分離純化蛋白質(zhì)。海:華東理工大學(xué),2002:46.7嚴?？? 生化分離工程M .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001:1772179.8Albert sson P A. Partitio

18、n of Cell Particles and Macromolecules(3rd ed M .New Y ork :JohnWilley , 1986:84288.9陸強, 鄧修. 提取與分離天然產(chǎn)物中有效成分的新方法雙水相萃取技術(shù)J.中成藥,2000,22(9 :6532655.10譚平華, 林金清, 肖春妹, 等. 雙水相萃取技術(shù)研究進展及應(yīng)用J.化工生產(chǎn)與技術(shù),2003,10(1 :19222.11Johansson Hans 2Olof ,Josefine P , Tjerneld Folke. Thermosepa 2rating water/polymer system :Anovel one 2polymer aqueous two 2phase system for protein purification J .Biotechnol Bioeng , 1999,66(4 :2472257.Study on Partition and