缺血預(yù)處理減輕骨骼肌缺血再灌注損傷

1、    缺血預(yù)處理減輕骨骼肌缺血再灌注損傷        【摘要】目的觀察缺血預(yù)處理對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法選擇24只健康兔，隨機(jī)等分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組先進(jìn)行缺血預(yù)處理，再持續(xù)阻斷后肢血流4 h；對照組直接阻斷后肢血流4 h，制作骨骼肌缺血再灌注損傷模型。測定再灌注期血清中肌酸磷酸激酶(CPK)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，鏡下觀察骨骼肌結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組血清中CPK和AST的含量均明顯低于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組骨骼肌線粒體空泡變性和肌

2、原纖維溶解程度明顯輕于對照組。結(jié)論缺血預(yù)處理能增強(qiáng)骨骼肌對缺血的耐受性，減輕骨骼肌缺血再灌注損傷程度?！娟P(guān)鍵詞】再灌注損傷；肌，骨骼；缺血預(yù)處理；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；肌酸激酶；兔【中分類號】R685.4; R364.2; R345Ischemic preconditioning reduces ischemia and reperfusion injury of skeletal muscleTang Shouying, Wang Xiaojun(Department of Orthopaedics, The 251st Hospital of PLA, Zhangjiakou, Hebei075

3、000)【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of protecting skeletal muscle from ischemia and reperfusion injury with ischemic preconditioning. Methods24 healthy rabbits were selected and randomly divided into either experiment or control group equally.The model of ischemia and reperfusion injury was

4、 made by stopping blood flows of rabbit?s hind limbs for 4 hours, the experiment preconditioned and the control undergoing nothing.The contents of creatine phosphate kinase (CPK) and aspartate aminotransferase (AST) in the serum were measured respectively during reperfusion. Structural changes of th

5、e skeletal muscle were observed with light and electron microscope. ResultsThe contents of CPK and AST in the experimental group were lower than that in the control (P<0.05). Compared with the control, mitochondrial vacuolar degeneration and dissolution of myofibril in the experimental group were

6、 significantly reduced. ConclusionIPC enhances the continuous ischemic tolerance of skeletal muscle and reduces its ischemia and reperfusion injury.【Key words】reperfusion injury; muscle, skeletal; ischemic preconditioning; aspartate aminotransferase; creatine kinase; rabbit缺血預(yù)處理(ischemic preconditio

7、ning，IPC)能提高組織對缺血的耐受性，減輕組織缺血再灌注損傷。有關(guān)IPC在骨科領(lǐng)域里的實(shí)驗(yàn)研究比較少，筆者模擬臨床氣囊止血帶的應(yīng)用方法，制作家兔后肢缺血再灌注損傷模型，觀察了IPC對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組選擇體重2.43.2 kg的健康兔24只，不限，隨機(jī)等分為缺血預(yù)處理(實(shí)驗(yàn))組和非處理(對照)組，每組中再分為血清酶測定(8只)和組織學(xué)檢查(4只)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購于華北制藥股份有限公司質(zhì)量檢驗(yàn)處(冀動(dòng)字第0005號)。1.2動(dòng)物模型的制作用20 g.L-1戊巴比妥鈉(30mg.kg-1)耳靜脈麻醉動(dòng)物，雙后肢脫毛，在大腿根部環(huán)繞氣囊止血帶(長25

8、cm，寬3 cm)，止血壓力為36 kPa。實(shí)驗(yàn)組先進(jìn)行2次10 min間斷缺血與2次10 min間斷灌注預(yù)處理，再持續(xù)缺血4 h；對照組直接持續(xù)缺血4 h。然后松開止血帶，恢復(fù)肢體血流。1.3觀察指標(biāo)1.3.1肢體功能實(shí)驗(yàn)結(jié)束后5天內(nèi)，每天觀察肢體腫脹程度和行走情況。1.3.2血清酶缺血前抽心臟血2 ml,于再灌注10 min和1、2 h分別抽心臟血各2 ml。用瑞士COBAS MIRA全自動(dòng)生化分析儀測定每份血清中肌酸磷酸激酶(CPK)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量。1.3.3骨骼肌結(jié)構(gòu)于缺血2、4 h及再灌注1、2 h取雙側(cè)腓腸肌標(biāo)本，分別按光鏡和電鏡常規(guī)固定、脫水、包埋、切片。光

9、鏡切片用HE染色，電鏡切片用醋酸鈉檸檬酸鈣雙重染色，用光學(xué)顯微鏡和日本JEM2000 EX型透射電鏡觀察骨骼肌結(jié)構(gòu)變化。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析血清酶檢測結(jié)果以±s形式表示，數(shù)值間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1肢體功能恢復(fù)肢體血流后，缺血肢體均出現(xiàn)不同程度腫脹，肢體行走功能喪失。實(shí)驗(yàn)組于第2天開始恢復(fù)行走，沒有發(fā)生肢體壞死。對照組有2只在第2天恢復(fù)行走，8只在第3天后開始恢復(fù)行走，另有4只肢體功能未恢復(fù)，其中1只肢體呈進(jìn)行性腫脹、壞死。2.2血清酶變化再灌注后動(dòng)物血清中CPK和AST均有不同程度的升高，兩組各時(shí)間段比較顯示，實(shí)驗(yàn)組CPK和AST均明顯低于對照組，差異有顯著性(P<0.05

10、)，見表1。表1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中CPK和AST的變化(U.L-1，n=8，±s)組別缺血前再灌注 (min)1060120實(shí)驗(yàn)組CPK653.8±131.42 089.9±307.3*4 112.5±854.9*5 256.8±764.9*AST90.4±14.8113.5±17.9*142.4±30.7*181.1±35.4*對照組CPK617.0±157.52 682.4±551.7*+5 495.1±730.7*+7 073.4±1 068.9*+AST94.3

11、±15.0135.4±21.1*+187.6±33.9*+232.1±33.2*+實(shí)驗(yàn)組與對照組比較：+P<0.05，+P<0.01再灌注后與缺血前比較：*P<0.05， *P<0.012.3骨骼肌結(jié)構(gòu)變化光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，缺血2 h肌纖維結(jié)構(gòu)正常，缺血4 h肌纖維出現(xiàn)水腫，部分區(qū)域HE染色變淺， 兩組間比較無明顯差別(1)。再灌注后兩組肌纖維及間質(zhì)水腫均逐漸加重，再灌注2 h對照組部分肌纖維出現(xiàn)斷裂，而實(shí)驗(yàn)組肌纖維尚完整(2)。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，缺血2 h對照組線粒體明顯腫脹，部分嵴消失呈空泡樣變，實(shí)驗(yàn)組線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。缺血4

12、h對照組線粒體大部分嵴消失，空泡樣變性明顯加重，實(shí)驗(yàn)組僅部分嵴消失及空泡樣變，兩組肌原纖維明暗帶仍清晰(3)。再灌注1 h，對照組線粒體空泡變性加重，肌原纖維水腫分離，部分肌原纖維溶解，實(shí)驗(yàn)組肌原纖維水腫分離及溶解不明顯。再灌注2 h，對照組肌原纖維水腫分離及溶解明顯加重，實(shí)驗(yàn)組亦有加重，但輕于對照組(4)。1缺血4 h，肌纖維水腫，兩組間無明顯差別左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)為對照組。HE×2002再灌注2 h，肌肉組織水腫明顯，實(shí)驗(yàn)組肌纖維完好，對照組部分肌纖維斷裂左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)為對照組。HE×2003缺血4 h，線粒體腫脹，嵴消失，呈空泡樣變性。實(shí)驗(yàn)組輕于對照組左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組

13、，右側(cè)為對照組。×20 0004再灌注2 h，肌原纖維水腫，分離，部分肌原纖維溶解，實(shí)驗(yàn)組輕于對照組左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)為對照組。×20 0003討論各種組織對缺血的耐受性存在著很大的差別，肢體耐受性最差的組織為骨骼肌。當(dāng)肢體缺血超過3 h，骨骼肌將發(fā)生嚴(yán)重的缺血再灌注損傷1。骨骼肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增高，正常情況下位于細(xì)胞內(nèi)的CPK和AST釋放到細(xì)胞外進(jìn)入血液循環(huán)。測定血中酶含量的變化，可以反映出骨骼肌細(xì)胞受損的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 再灌注后實(shí)驗(yàn)組血清中CPK和AST含量明顯低于對照組，差異有顯著性。說明實(shí)驗(yàn)組骨骼肌細(xì)胞膜通透性低，再灌注損傷程度比較輕。鏡下對比

14、觀察骨骼肌結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組骨骼肌纖維無斷裂現(xiàn)象，骨骼肌細(xì)胞線粒體空泡樣變和肌原纖維水腫分離、溶解程度明顯輕于對照組，進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)組骨骼肌發(fā)生缺血再灌注損傷程度比較輕。綜合血清酶和鏡下骨骼肌結(jié)構(gòu)變化，可以得出結(jié)論:IPC能提高骨骼肌對長時(shí)程缺血的耐受性，可減輕骨骼肌缺血再灌注損傷程度。IPC對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已在實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)，對其病理生理機(jī)制有多種解釋。有人認(rèn)為IPC對缺血組織的保護(hù)作用與其降低缺血組織對高能磷酸鹽的需要、減慢糖酵解速度、減少乳酸在局部組織內(nèi)的蓄積量有關(guān)2。后來的實(shí)驗(yàn)研究3顯示，預(yù)先給Wistar大鼠進(jìn)行IPC或靜脈注射腺苷(350g.kg-1.min-

15、1)，然后缺血60 min，再灌注30 min，結(jié)果顯示IPC和腺苷對骨骼肌最大收縮力量及高能磷酸鹽的儲備均有明顯保護(hù)作用。認(rèn)為IPC激發(fā)了內(nèi)源性腺苷的釋放，通過腺苷調(diào)解，降低高能磷酸鹽分解代謝，改善骨骼肌功能。另有研究報(bào)道4，給Wistar大鼠進(jìn)行IPC后持續(xù)缺血3 h，再灌注2 h，實(shí)驗(yàn)組骨骼肌收縮功能、最大肌張力和肌肉耐疲勞強(qiáng)度均比缺血與再灌注相同時(shí)間的對照組明顯增強(qiáng)，而高能磷酸鹽消耗和儲備量無明顯差別。認(rèn)為IPC對缺血骨骼肌的保護(hù)作用，是通過激活細(xì)胞膜ATP依賴性鉀通道，維持骨骼肌細(xì)胞正常代謝，從而減輕骨骼肌細(xì)胞損傷程度，改善骨骼肌收縮功能、提高其耐疲勞強(qiáng)度，與高能磷酸鹽的儲備量無關(guān)。

16、目前對IPC的確切病理生理機(jī)制還不很清楚，有待進(jìn)一步研究。作者簡介：湯守營，男，40歲，副主任醫(yī)師。研究方向:再灌注損傷作者單位：湯守營解放軍251醫(yī)院骨科，河北張家口075000王曉軍解放軍52968部隊(duì)醫(yī)院外科，河北張家口075000參考文獻(xiàn)1周躍，梅芳瑞，曾維權(quán). 止血帶下肢體缺血再灌流損傷的實(shí)驗(yàn)探討. 中華創(chuàng)傷雜志，1990;6(4):2172192Pang CY, Forrest CR. Acute pharmacologic preconditioning: a new concept and alternative approach for prevention of skeletal muscle ischemic necrosis.Biochem Pharmacol,1995;49(8):1 0231 0343Lee HT,Schroeder CA,Shah PM, et al. Preconditioning with is-chemia or adenosine