食源性微生物快速檢測研究現(xiàn)狀（二）

1、食源性微生物快速檢測研究現(xiàn)狀（二） 1.免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)志在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下展現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),可用來對、和單核細胞增生李斯特菌等舉行迅速檢測。該技術(shù)的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快,但還存在不足,如非特異性染色問題尚未徹低解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序比較復(fù)雜。 2.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是將抗原或抗體吸附于同相載體,在載體上舉行免疫酶染色。底物顯色后,通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。它結(jié)合了免疫熒光法和發(fā)射免疫測定法兩種技術(shù)的優(yōu)點,具有可定量、反應(yīng)

2、敏捷精確、標(biāo)志物穩(wěn)定、適用范圍寬、結(jié)果推斷客觀、簡便徹低、檢測速度快以及費用低等特點,可同時舉行上千份樣品的分析。 3.酶聯(lián)熒光免疫吸附技術(shù) 酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來,在一般酶免疫分析的基礎(chǔ)上用抱負(fù)的熒光底物代替生色底物,可提高分析的敏捷度和增寬測量范圍,削減試劑的用量。酶放大技術(shù)、固相分別及熒光檢測三者的聯(lián)合將成為熒光免疫分析中最敏捷的辦法。 4.免疫磁珠分別技術(shù) 免疫磁珠分別技術(shù)是將磁性微球與免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來的一種技術(shù)。該技術(shù)是先用抗體包被的磁珠與樣品混合,再用一個磁場裝置收集磁珠。該技術(shù)可迅速從食品成分中分別出靶細菌,克服了挑選性培養(yǎng)基的抑制作用問題。據(jù)報道

3、,用免疫磁珠分別技術(shù)從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分別出沙門菌,其檢測限為每克1×102個細菌。假如和其他檢驗辦法相結(jié)合,則可數(shù)倍地提高分別效率和檢測限。 5.免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以微孔濾膜為載體包被已知抗原或抗體,加入待檢標(biāo)本后,經(jīng)濾膜的毛細管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合,再用膠體金結(jié)合物標(biāo)志而達到檢測目的。顯色程度與抗原含量成正比,因而用于定性或半定量的迅速免疫檢測辦法中,其特點是敏捷度和特異性都較高,且操作簡便、迅速、結(jié)果精確,不需任何儀器設(shè)備,易于判讀,幾分鐘就可用肉眼觀看到色彩鮮亮的試驗結(jié)果,并可保存試驗結(jié)果。目前已有特地用來檢測食品

4、及環(huán)境中沙門菌抗原的商品沙門菌檢測卡。 6.免疫印跡技術(shù) 免疫印跡技術(shù)分3個步驟:第一,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(sds-page),將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶;其次,電轉(zhuǎn)移,目的是將凝膠中已分別的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上;第三,酶免疫定位,目的是將前兩步中已分別,但肉眼不能見到的抗原帶顯示出來。將印有蛋白抗原條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標(biāo)志的其次抗體反應(yīng)后,再與能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物作用,終于使區(qū)帶染色。該辦法綜合了sds、page的高辨別率及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(elisa)的高敏感性和高特異性,是一種有效的分析手段,在蛋白質(zhì)化學(xué)中應(yīng)用廣泛,既

5、可用于分析抗原組分及其免疫活性,也可用于疾病的診斷。 (六)分子生物檢測技術(shù) 1.分子雜交技術(shù) 分子雜交技術(shù)是指利用核糖核酸(rna)和脫氧核糖核酸(dna)可以和特定微生物的核酸相結(jié)合,來診斷和鑒別微生物的一種技術(shù)。該技術(shù)可以解決抗體檢測的特異性問題,但需要相對大的樣本量,才干獲得明確的結(jié)果,所以在食品微生物方面主要是利用瓊脂平板上的細菌菌落舉行雜交。 2.pcr技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)是近十多年來應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)辦法,在食源性致病菌的檢測中均是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設(shè)計特異引物舉行擴增,進而用凝膠電泳和紫外核酸檢測儀觀看擴增結(jié)果。其中,依靠pcr的dna指紋圖譜技術(shù)、多重

6、pcr檢測技術(shù)及實時熒光定量pcr技術(shù)等應(yīng)用最為廣泛。 (1)依靠pcr的dna指紋圖譜技術(shù) 依靠pcr的dna指紋圖譜技術(shù)是通過各種改進的pcr技術(shù),使目標(biāo)微生物的核酸經(jīng)擴增后,產(chǎn)生多條dna擴增片段,通過統(tǒng)計分析找出某種微生物的特征條帶,舉行區(qū)分鑒定。 (2)隨機引物擴增dna多態(tài)性(rapd)技術(shù) rapd技術(shù)主要用于不考慮微生物核酸精確序列的狀況下,比較微生物間的dna指紋圖譜差異,用于細菌種間的鑒定,louie等比較了核酸分型技術(shù)、rapd技術(shù)和脈沖場凝膠電泳技術(shù)用于李斯特菌的分型鑒定,結(jié)果顯示后兩種辦法效果較好。 (3)基因內(nèi)重復(fù)性全都序列(eric)的擴增 eric片段是存在于腸

7、道細菌核酸中的重復(fù)dna序列,分布在細菌染色體的不同位點上且以不同的距離分隔。因此,以這些重復(fù)的dna片段作為pcr擴增時引物的結(jié)合位點,使其被分隔的片段大量擴增,在凝膠電泳上形成一系列的條帶,從而區(qū)別不同的腸道細菌。該辦法引用的引物序列固定,結(jié)果的重復(fù)性更好。 (4)多重pcr(m-pcr)技術(shù) mpcr是指在同一個反應(yīng)體系中,加入多對特異性引物,假如存在與各引物對特異性互補的模板,即可同時在同一反應(yīng)管中擴增出一條以上的目的dna片段。mpcr技術(shù)的建立,實現(xiàn)了多種食源性致病菌的同時檢測。 3.基因芯片技術(shù) 基因芯片是指根據(jù)預(yù)定位置固定在同相載體上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子所組成的微點陣列。其檢測致病菌原理為:挑選細菌的共有基因(16s rdna、23srdna及eric)作