人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素基因調(diào)控序列的克隆與鑒定

1、    人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素基因調(diào)控序列的克隆與鑒定王輝鄧潔英鄭德先史軼蘩中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)R392.11摘要目的：克隆和鑒定人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素(irGH)基因調(diào)控序列的核苷酸順序。方法：通過(guò)PCR擴(kuò)增出人淋巴細(xì)胞irGH基因5"近端的調(diào)控序列，然后將其與質(zhì)粒PGEM7Zf(+)連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化藍(lán)白斑篩選、酶切鑒定，獲得PGEM7Zf(+)-irGH DNA (-484-+2 bp)重組質(zhì)粒，進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果：顯示irGH基因5"近端的調(diào)控序列與垂體細(xì)胞GH基因的5"近端調(diào)控序列的核苷酸順序完全相同。結(jié)論：該結(jié)果

2、進(jìn)一步證明免疫系統(tǒng)與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的密切關(guān)系。關(guān)鍵詞生長(zhǎng)激素基因調(diào)控序列人淋巴細(xì)胞Cloning and nucleotide sequencing of the 5"-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human lymphocyteWANG Hui,DENG Jie-Ying,ZHENG De-Xian et al. Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Me

3、dical College,Beijing 100730AbstractObjective：Cloning and nucleotide sequencing of the 5"-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human 1ymphocyte.Methods:The immunoreactive growth hormone(irGH) DNA fragments were obtained by PCR with normal human peripheral blood lymphocyte DN

4、A as template.Then,the plasmids of PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp) were constructed by ligation of irGH DNA with PGEM7Zf(+),transformation,blue/white color selection and restriction enzyme analysis.The 5"-flanking region of irGH were sequenced by using sanger's dideoxynucleitide chain-temin

5、ation reaction.Results:It was demonstrated that the sequence data of 5"-flanking region(-484-+2 bp) in irGH gene was identical to that of pituitary GH gene.Conclusion:The results indicate a close relationship between immune system and neuroencrine system.Key wordsGrowth hormone genePromoterLymp

6、hocytes已發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的內(nèi)分泌腺體、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，中樞及外周免疫器官也能產(chǎn)生多種激素和神經(jīng)肽，此外還證實(shí)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的細(xì)胞能表達(dá)細(xì)胞因子、激素及神經(jīng)肽的受體1。淋巴細(xì)胞能分泌免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素(Immunoreactive GH，irGH)，它是淋巴細(xì)胞的一種自分泌和旁分泌生長(zhǎng)因子，在抗原性、分子量、生物活性及mRNA大小等方面與垂體GH相似。本實(shí)驗(yàn)室證實(shí)人淋巴細(xì)胞表達(dá)的irGH cDNA編碼序列與垂體hGH cDNA的序列是相同的2，3，但目前有研究表明淋巴細(xì)胞分泌GH與垂體分泌GH的調(diào)控機(jī)制是不同的。本實(shí)驗(yàn)室為了從分子水平上探討淋巴細(xì)胞irGH基因

7、表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，首先克隆irGH基因的5"上游調(diào)控序列，進(jìn)行序列分析和鑒定。1材料與方法1.1菌株及質(zhì)粒DH5及PGEM7Zf(+)質(zhì)粒為本室保存。1.2試劑內(nèi)切酶(SmaI、BamHI、EcoRI)、T4 DNA連接酶、Klenow大片段酶、Taq DNA聚合酶、Wizard PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)、fmol DNA測(cè)序試劑盒均為美國(guó)Promeaga公司產(chǎn)品。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA/EcoRI+Hind、PBR322/hinf為華美公司產(chǎn)品，PCR引物由北京賽百勝(美國(guó))生物工程公司合成，32P-dATP為北京亞輝公司產(chǎn)品。1.3PCR引物的設(shè)計(jì)為了擴(kuò)增irGH基因5"上游序

8、列，按照文獻(xiàn)4設(shè)計(jì)出上游引物(P1)(-484-467 bp):5"-GACTGAATCGTGCTCAC-3"和下游引物(P2)(+441-+464 bp):5"-GGTGCAGACGATGGGCGCGGAGC-3"。1.4irGH基因(-484-+464 bp)片段的擴(kuò)增取正常人抗凝外周血，分離出淋巴細(xì)胞，用酚抽提法分離DNA，純化后取300 ng作模板，加2 mmol/L dNTP混合物2 l和引物P1、P2各200 pmol/L、2.5 U Taq DNA聚合酶，在50 l終反應(yīng)體積中按以下方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增；95，5 min；94，1 min，6

9、0，1 min，72，2 min，30個(gè)循環(huán)；72，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用Wizard PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)回收。1.5irGH(-484-+464 bp)重組質(zhì)粒的構(gòu)建首先取3.0 g PGEM7Zf(+)加入SmaI 20 U，在20 l反應(yīng)體系中，25水浴水解3 h。然后加入PCR擴(kuò)增的irGH基因(-484-+464 bp)片段1.6 g加入5 U Klenow大片段酶、5 mmol/L dNTP 1 l。12水浴3 h，將irGH DNA片段兩端補(bǔ)齊。然后加入0.1倍體積的3 mmol/L醋酸鈉和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇，放入-20冰箱1 h，取出后4 離

10、心，12 000 r/min，30 min，去上清后冷凍干燥3 min，加入下列試劑：6 U T4 DNA連接酶、10×連接緩沖液2 l、SmaI 10 U、50% PEG8000 6 l，補(bǔ)足至20 l，16水浴過(guò)夜。然后取DH5a感受態(tài)細(xì)胞100 l，加入10 l連接緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而后在含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選，即為irGH(-484-+464 bp)重組質(zhì)粒。1.6irGH DNA(-484-+2 bp)重組質(zhì)粒的構(gòu)建取數(shù)個(gè)白色菌落分別種入含有氨芐青霉素(50 g/ml)LB培養(yǎng)基的試管中，37振蕩過(guò)夜，采用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒的少量

11、提取，1%瓊脂糖凝膠電泳，選出PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重組質(zhì)粒，如圖1所示用BamHI酶切、鑒定獲得正確的克隆，即irGH (-484-+2 bp)質(zhì)粒。1.7irGH基因5"上游核苷酸序列的測(cè)定以PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp)重組質(zhì)粒為模板，用PUC/M13正反向引物行雙鏈雙脫氧DNA人工測(cè)序，按fmol測(cè)序試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。  圖1PGEM7Zf(+)-irGH測(cè)序質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1Construction of sequencing plasmid PGEM7ZF(+)-irGH2

12、結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增irGH基因片段(-484-+464 bp)結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)一大約900 bp的特異條帶，該條帶即為包括irGH 5"上游調(diào)控序列的DNA片段(-484-+464 bp)。2.2PGEM7Zf(+)-irGH DNA重組克隆的鑒定PGEM7Zf(+)和irGH DNA(-484-+464 bp)行平端連接后，經(jīng)藍(lán)、白斑篩選，獲得數(shù)10個(gè)白色菌落。取其中8個(gè)白色菌落進(jìn)行質(zhì)粒少量提取，瓊脂糖電泳分析表明3個(gè)質(zhì)粒為含有irGH DNA(-484-+464 bp)的克隆。然后經(jīng)BamHI酶切分析，如圖2所示，質(zhì)粒1、2切下的片段小(+3-+464

13、 bp)證明為正向連接，而質(zhì)粒3切下的片段大(-484-+464 bp)為反向連接。然后將切下了小片段的質(zhì)粒1、2用T4 DNA連接酶連接，即得到PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重組質(zhì)粒。  圖2重組質(zhì)粒的瓊脂糖電泳Fig.2Photogram of reconstructed plasmid digested with BamHI and analyzed by electrophoresis in agarose gel containing EB2.3irGH DNA 5"上游核苷酸調(diào)控序列的測(cè)定結(jié)果如圖3，與垂體GH基因的調(diào)控序列是

14、一致的。-484GACTGAATCGTGCTCACAACCCCCACAATCTATTGGCTGTGCTTGGCCCCTTTTCCCAAC-424ACACACATTCTGTCTGGTGGGTGGAGGTTAAACATGCGGGGAGGAGGAAAGGGATAGGAT-364AGAGAATGGGATGTGGTCGGTAGGGGGTCTCAAGGACTGGCTATCCTGACATCCTTCTCC-304GCGTTCAGGTTGGCCACCATGGCCTGCGGCCAGAGGGCACCCACGTGACCCTTAAAGAGA-244GGACAAGTTGGGTGGTATCTCTGGCTGACACTCTGT

15、GCACAACCCTCACAACACTGGTGA-184CGGTGGGAAGGGAAAGATGACAAGCCAGGGGGCATGATCCCAGCATGTGTGGGAGGAGCT-124TCTAAATTATCCATTAGCACAAGCCCGTCAGTGGCCCCATGCATAAATGTACACAGAAAC-64AGGTGGGGGCAACAGTGGGAGAGAAGGGGCCAGGTATAAAAAGGGCCCACAAGAGACCAG-4CTCAAG圖3人irGH DNA 5"上游調(diào)控核苷酸序列Fig.3Nucleotide sequence of the 5"-flanking

16、region of irGH gene of human lymphocytes3討論Hiestand等于1986年首先報(bào)道了用大鼠的GH和PRL特異性的mRNA探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，發(fā)現(xiàn)激活的淋巴細(xì)胞胞漿中有GH和PRL的mRNA存在5，隨后人們就irGH分子量的大小、mRNA的表達(dá)量及irGH的分泌等方面進(jìn)行了研究，證明在胸腺、骨髓、外周血細(xì)胞及脾臟分離出的T和B細(xì)胞都可分泌irGH。Kao等研究發(fā)現(xiàn)GHRH、TRH、CRH、胰島素、睪酮、雌激素、胸腺素-5、生長(zhǎng)抑素、IGF-I、腎上腺素等均不影響淋巴細(xì)胞系H9細(xì)胞分泌irGH6，Hattori等報(bào)道外源性GH能增加植物血凝素(PHA)刺激的

17、人外周血淋巴細(xì)胞irGH的分泌，并且是劑量依賴(lài)性的，這表明淋巴細(xì)胞irGH和垂體GH的分泌調(diào)控機(jī)制是不同的7。劉軍喜等對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的irGH cDNA及Rohn等對(duì)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的irGH cDNA分別進(jìn)行了克隆和序列分析，結(jié)果證明淋巴細(xì)胞irGH cDNA與垂體GH cDNA的核苷酸序列完全相同2，3，并且Rohn還證明大鼠irGH的調(diào)控序列(-300 bp)與大鼠垂體GH基因調(diào)控序列是一致的8。有研究表明：人GH的289 bp調(diào)控序列就可滿(mǎn)足垂體GH基因表達(dá)的需要9，為深入探討irGH表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本研究首先對(duì)irGH基因5"上游調(diào)控序列(-484 bp-+2 bp)進(jìn)

18、行了克隆和測(cè)序分析。垂體細(xì)胞表達(dá)GH主要受垂體特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Pit-1蛋白影響，Pit-1蛋白結(jié)合GH基因的部位在5"上游調(diào)控序列-80 bp左右和-122 bp左右兩個(gè)位點(diǎn)。目前尚不清楚為什么淋巴細(xì)胞irGH和垂體GH分泌調(diào)控不同。Gellersen等通過(guò)對(duì)Pit-1 mRNA的RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)胸腺細(xì)胞、Jurkat淋巴瘤細(xì)胞及PHA刺激的外周血淋巴細(xì)胞均有較弱的Pit-1條帶存在，并且Pit-1條帶的強(qiáng)弱與這些細(xì)胞分泌催乳素(hPRL)的多少無(wú)關(guān)10，我們推測(cè)人淋巴細(xì)胞irGH和垂體GH表達(dá)調(diào)控機(jī)制不同的原因可能是：淋巴細(xì)胞受細(xì)胞因子的自分泌和旁分泌影響；淋巴細(xì)胞內(nèi)調(diào)控G

19、H表達(dá)的Pit-1蛋白表達(dá)量太少，對(duì)irGH表達(dá)不起主要調(diào)控作用。要闡明淋巴細(xì)胞irGH表達(dá)的調(diào)控機(jī)理還需進(jìn)行更深入的研究。本實(shí)驗(yàn)證明人外周血淋巴細(xì)胞分泌的irGH基因調(diào)控序列(+484-2 bp)與垂體GH相應(yīng)調(diào)控序列是完全一致的，這為我們進(jìn)一步探討irGH分泌的基因調(diào)控機(jī)制和irGH對(duì)淋巴細(xì)胞功能的影響打下了良好的基礎(chǔ)。人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素基因調(diào)控序列的克隆與鑒定國(guó)家自然科學(xué)基金資助(39370340)人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素基因調(diào)控序列的克隆與鑒定王輝河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新鄉(xiāng)453003鄭德先中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生化室，北京100005作者簡(jiǎn)介：王輝，男，33

20、歲，在職博士生，副教授，主要從事神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學(xué)方面的研究；鄧潔英，女，58歲，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事垂體激素及疾病的基礎(chǔ)研究作者單位：(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730)4參考文獻(xiàn)1王輝，鄧潔英，史軼蘩.淋巴細(xì)胞分泌的免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)*免疫學(xué)分冊(cè)，1997；20(4)：1962劉軍喜，鄭德先，鄧潔英 et al. 人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性生長(zhǎng)激素mRNA的擴(kuò)增與鑒定.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1996；18(5)：3703劉軍喜，鄭德先，鄧潔英 et al. 人淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性在生長(zhǎng)激素cDNA的克隆、序列測(cè)定與人垂體生長(zhǎng)激素cDNA的比較研究.

21、中華內(nèi)分泌代謝雜志，1997；13(1)：34Chen E Y,Liao Y C,Smith D H et al.The human growth hormone locus; nucleotide sequence,biology,and evolution.Genomics,1989;4:4795Hiestand P C,Mekler P,Nordmann R. Prolactin as a modulator of lymphocyte responsiveness provides a possible mechanism of action for cyclosporine.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:25996Kao T L,Meyer W J. Inhibition of immunoreactive growth hormone secretion from lymphoid cell li