新型重組免疫抑制融合毒素蛋白B72PE40KDEL的分離純化

1、新型重組免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分離純化關(guān)海容，孫玉英，袁志宏，張惠麗，梁飛，劉楠，郭斯啟,習(xí)彩霞，奚永志【摘要】為了成立高效快捷能分離大量重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游純化線路，比較了不同組合的純化策略和條件，包括反相層析、金屬螯合層析、陰離子互換層析、藍(lán)染料親和層析和凝膠過濾層析等，并采納MTT法檢測該融合蛋白的靶向殺傷活性。結(jié)果說明，在反相層析分離中疏水相別離采納了常規(guī)的甲醇和乙月青，結(jié)果為所分離的該重組融合蛋白均發(fā)生了變性，從色譜柱中分離出來就生成了絮狀沉淀。在藍(lán)染料親和層析一步分離中，由于全菌體蛋白中與親和樹脂發(fā)生非特異結(jié)合的成份較多，極難區(qū)分目

2、的蛋白和雜蛋白。可是，PRSETA-B7-2-PE40KDEL表達(dá)載體上帶有翻譯增強(qiáng)序列T7-glO,可在表達(dá)目的蛋白N端融合6個組氨酸，這十分有利于通過Xi-NTA金屬黎和層析法快速高純度地純化表達(dá)產(chǎn)物。依照這一特性，經(jīng)反復(fù)挑選實驗設(shè)計最終確信了金屬螯合層析、陰離子互換層析和凝膠過濾層析三步法的純化線路，用于純化分離B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的純度可達(dá)95%以上，總回收率為8%。Western-blot實驗顯示,所得蛋白可與B7-2及PEA抗體特異性結(jié)合；MTT生物活性測定說明，該融合蛋白對表達(dá)CD28受體的人T細(xì)胞系Jurkat產(chǎn)生特異性殺傷作用，而對不表達(dá)CD28

3、的淋巴細(xì)胞系Raji無任何殺傷作用。結(jié)論：成立了高效快速純化大量重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技術(shù)線路，所純化的重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特異性靶向殺傷表達(dá)CD28受體的人T細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】重組外毒素融合蛋白EstablishmentofPurificationProcedureforRecombinantFusionProteinB7-2-PE40KDELAbstractThisstudywasaimedtoestablishdownstreampurificationprocedurebywhichtheproteinofinterestcanbepurifiedt

4、ohigherpurityrapidlyandefficiently.Thedifferentcombinationsofvariouspurificationstrategiesmethodsandconditionswerecompared，includingreversedphasechromatography,metalchelatingchromatography,anionexchangechromatography,bluedyeaffinitychromatography,filtrationchromatographyandsoon.Theresultsshowedthati

5、nreversedphasechromatography,isolatedproteinofinterestwasdenaturedandprecipitatedimmediatelyafterchromatographybecausemethanoloracetonitrilewereadoptedastheorganicphase.Inbluedyeaffinitychromatographyexpectingtopurifytheproteinofinterestinonestep,proteinofinterestwasdifficultly,differentiatedfrommix

6、edproteinasmuchproteinsboundtothechromatographymediabynon-specificaffinity.Whilethereisatrans1ation-enhancingsequenceT7-gl0inthePRSETA-B7-2-PE40KDELexpressionvector,soitadds6histidinestotheNterminusoftheproteinofinterest,thisallowstopurifytheproteinofinterestbymetalchelatingchromatography.Basedonthi

7、scharacteristicathree-stepchromatographylineincludingmetalchelatingchromatography，anionexchangechromatographyandfiltrationchromatographywasfinallyestablishedafterrepeatedexperiments.Bythiswaythepurityofproteinofinterestreached95%andthetotalrecoveryratewas8%.TheresultofWesternblotindicatedthattheexpr

8、essedandpurifiedrecombinantB7-2-PE40KDELcouldspecificallybindwithmAbagainsthumanB7-2andmultipleantibodyagainstPEA.ThecytotoxicityoftherecombinanttoxintestedbyMTTmethodshowedthattheB7-2-PE40KDELcouldselectivelykillJurkatcelllineexpressingCD28receptorwellandhadnokillingeffectontheRajicelllineunexpresi

9、ngCD28receptor.Itisconcludedthatahighefficientandspeedythree-steppurificationprocedureforthepurifingrecombinantproteinB7-2-PE40KDELwasestablishedandthisprocedurepossessselectivekillingactivityonCD28positiveTlymphocytes.Keywordsrecombinationexotoxinfusionprotein；B7-2-PE40KDEL；proteinpurification；sele

10、ctivekilling；biologicalactivity眾所周知，在原核表達(dá)載體的宿主菌大腸桿菌菌體內(nèi)有上千種的各類雜蛋白，有些蛋白在很多方面與外源重組蛋白具有相同或相似的理化特性，乃至可能會與外源重組蛋白發(fā)生非特異性作用乃至于將其酶解，因此，重組蛋白質(zhì)的純化分離始終是基因工程研究中一個重要的限速環(huán)節(jié)1,21再者，由于不同的重組蛋白的理化性質(zhì)千差萬別,不可能有一個適于純化各類蛋白固定的純化模式或程序，因此必需依照不同重組目的蛋白的特性選擇組合不同的純化方案。這往往需要反復(fù)試探各類純化條件方能成立起比較理想的能適合相應(yīng)目的蛋白的純化策略或方式3,4。最近幾年來人們在探討重組蛋白的下游純化研

11、究中，為了更快、更好、更有效地分離純化目的蛋白，提高純化效率，多偏向于在最初設(shè)計構(gòu)建重組蛋白時，就在其N端或C端添加一段相關(guān)序列，以作為純化標(biāo)記。目前如此的純化標(biāo)記有多種，如GST、6個組氨酸等等。它們的一起特點確實是能夠與相應(yīng)的親合樹脂高特異性的結(jié)合，從而極大地提高純化的效率5-7o本研究室在設(shè)計構(gòu)建PRSETA-B7-2-PE40KDEL表達(dá)載體時，第一考慮到了上述業(yè)己存在的純化問題8。因此，除在其表達(dá)載體上采納了帶有翻譯增強(qiáng)和蛋白穩(wěn)固序列T7-gl0外，還在所要表達(dá)的目的蛋白B7-2-PE40KDELN端融合有6個組氨酸的標(biāo)簽，這將十分有利于通太高選擇性親和二價銀離子（nickel-ni

12、trilotriaceticacidNi-NTA）金屬螯合層析法高效純化表達(dá)產(chǎn)物。本研究旨在通過比較多種純化方式及多種純化條件，最終確立一條能高效、快捷、行之有效的可分離大量新型重組免疫抑制融合蛋白B7-2-PE40KDEL的下游純化線路。材料和方式菌種pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE為本研究室構(gòu)建保留的工程菌種8L要緊試劑和材料咪喋及兔抗PEA多抗（Sigma公司），胰蛋白陳、酵母提取物（Oxoid公司），MTT、XBT/BCIP試劑盒及堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（華麗生物工程公司），硝酸纖維素膜（AmershanPharmacia）,Tris（Augis）,透析

13、袋（Pierce公司），Um濾膜、濾器（Pall公司），超濾器（Millipore公司）。2YT培育基依照分子克隆實驗指南配制。樹脂別離為Ni-XTAbindingresin（Novagen公司），MonoQHR（5/5）及Superdex75（AmershamPharmacia）o工程菌的培育及誘導(dǎo)表達(dá)將工程菌種pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE接種于2YT培育基中，30培育12小時，按2%濃度接種于2YT培育基Amp+中，22培育小時，然后加入mmol/LIPTG誘導(dǎo)培育12小時。包涵體上清的分離將大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于44500rpm離心20分鐘，搜集菌體。以1/

14、20體積的緩沖液重懸凍于-20C,1小時后室溫水浴融化,再凍融2次，超聲破碎儀冰浴破碎（德國Braun公司）（大探頭，功率100,時刻20秒，頻率赫茲，重復(fù)3次），412000rpm離心15分鐘，將取得的上清以Um濾膜過濾備用。金屬螯合層析以3倍體積的緩沖液K50mmol/LNa2HP04(pH、mol/LNaCl平穩(wěn)金屬螯合層析柱，然后將濾好的包涵體上清上樣于His-binding柱，流速為lml/min,再以3倍體積的緩沖液沖洗后，以洗滌液150mmol/LNa2HP04(pH、mol/LNaCl、40mmol/L咪喋沖洗至紫外吸收值再也不變更，以搜集液K50nlmol/LNa2HP04(

15、pH、250mmol/L咪理洗柱并分段搜集，10%SDS-PAGE檢測純化的結(jié)果。陰離子互換層析將經(jīng)金屬螯合層析純化后的目的蛋白對透析液K50mmol/LNa2HP04(pH、2mmol/LEDTA、mol/LNaCl透析(1：50),期間換液2次備用；以含10%B液的A液K50mmol/LNa2HP04(pH、2mmol/LEDTA平穩(wěn)MonoQ陰離子互換柱后，以1ml/min的流速將透析后的蛋白液上樣，再以3nli含10斌液的A液平穩(wěn)層析柱后，進(jìn)行梯度洗脫，即經(jīng)20分鐘B液K50mmol/LNa2HP04(pH、2mmol/LEDTA>1mol/LNaCl含量由0至100%,流速是1

16、ml/min,分段搜集與按峰搜集相結(jié)合,無峰處每1ml一收，有峰處起每ml一收,10%SDS-PAGE檢測純化的結(jié)果。凝膠過濾以3倍柱體積的C液H50mmol/LNa2HP04(pH、2mmol/LEDTA、mol/LNaCl平穩(wěn)凝膠柱Superdex75后，用YM10超濾濃縮經(jīng)陰離子互換純化后的目的蛋白液，取200U1上樣后，以C液進(jìn)行分離，流速為ml/min,分段搜集與按峰搜集相結(jié)合，無峰處每1ml一收，有峰處起每ml收，10%SDS-PAGE檢測純化的結(jié)果。目標(biāo)組分的Westernblot實驗鑒定將純化后的目的蛋白液別離制樣進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳，將分離膠膠片與硝酸纖維素膜用

17、轉(zhuǎn)移緩沖液平穩(wěn)30分鐘，并將專用濾紙用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕。依照半干轉(zhuǎn)移儀說明操作，將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上；用含10%的小牛血清/PBS/疊氮鈉液封鎖2小時，加入一抗孵育1-2小時；用PBS洗滌3次后，再用mmol/LTris-HCKmol/LNaCl洗滌，盡可能將磷酸鹽洗凈；然后用10%小牛血清、Tris-HCl作為二抗稀釋液稀釋二抗，二抗與膜孵育1小時；隨后用mol/LTris-HCKmol/LNaCl至少洗滌3次，最后用NBT/BCIP試劑盒進(jìn)行顯色，至適當(dāng)顯色程度用蒸儲水洗去染色液終止反映。蛋白含量的測定考馬斯亮藍(lán)G-250法(Bradford法)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液由BSA配制。紫外吸收法：用紫外分光

18、光度計，別離測定蛋白溶液在280nm、260nm下的吸收值，依照公式計算。特異性殺細(xì)胞活性的MTT法檢測別離搜集處于對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞，將細(xì)胞用RPMI1640洗3遍后計數(shù)，以5X104個/孔的細(xì)胞濃度加入96孔培育板中，將純化的蛋白以Rm孔徑的濾膜過濾除菌后，依照2倍梯度稀釋后加入培育孔中，37、5%CO二、全濕度條件下培育72小時，用MTT法檢測B7-2-PE40KDEL融合蛋白的細(xì)胞毒殺傷作用。結(jié)果pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE表達(dá)菌體的破碎經(jīng)2次凍融后，大量菌體己經(jīng)破碎，可是，由于大量核酸的釋放破菌液變得超級粘稠，經(jīng)3次超聲破菌后，

19、破菌成效比較完全，破菌液變成半透明狀，粘度顯著下降，經(jīng)高速離心后，有少量沉淀主體為半透明凝膠狀，其要緊成份為DNA和細(xì)胞膜碎片，上清為淡黃色澄清液體。B7-2-PE40KDEL融合蛋白的金屬螯合層析結(jié)果超聲破碎表達(dá)菌后，離心搜集包涵體上清，進(jìn)行NTA金屬螯合層析。經(jīng)較高濃度咪喋(250nmiol/L)洗脫后，搜集洗脫峰，目的蛋白和其它一些雜蛋白被洗脫下來，如圖1所示，從電泳結(jié)果可見,現(xiàn)在目的蛋白的純度可達(dá)85%。B7-2-PE40KDEL融合蛋白陰離子互換層析結(jié)果經(jīng)金屬螯合層析的目的蛋白再經(jīng)陰離子互換層析后其純度達(dá)到約90%。圖2展現(xiàn)了采納MonoQ柱層析進(jìn)行鹽梯度洗脫的結(jié)果，目的蛋白要緊位于

20、峰1中，在鹽濃度達(dá)到mol/L時開始洗下。圖3為此峰搜集液的10%SDS-PAGE結(jié)果。B7-2-PE40KDEL融合蛋白凝膠過濾層析結(jié)果為取得更好的分離成效，咱們采納凝膠過濾層析進(jìn)一步分離經(jīng)前兩步層析純化后的目的蛋白，通過降低上樣體積和洗柱速度，目的蛋白和雜蛋白能夠得以更好地分離。圖4展現(xiàn)了凝膠過濾層析的層析進(jìn)程，目的蛋白在8ml開始洗下，位于峰1中。圖5展現(xiàn)了峰1搜集液的10%SDS-PAGE結(jié)果，經(jīng)凝膠掃描分析顯示目的蛋白純度約為95%。圖中箭頭所指條帶即為目的蛋白。融合蛋白純化效率及回收率咱們明白，任何分離純化進(jìn)程都會有不同程度的目的蛋白的丟失或損耗，在蛋白質(zhì)工程研究中關(guān)于目的蛋白的分

21、離純化回收率和純化效率的計算是一個必要進(jìn)程。附表所示為本研究中各層析進(jìn)程重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白回收率和純化效率。經(jīng)Ni-NTA金屬螯合層析+Mon。Q陰離子層析+Superdex75凝膠過濾層析三步純化，B7-2-PE40KDEL融合蛋白的最終回收率為8%oB7-2-PE40KDEL融合蛋白純化產(chǎn)物免疫印跡鑒定Westernblot檢測Ni-NTA金屬螯合層析、MonoQ陰離子層析及Superdex75凝膠過濾層析各步純化產(chǎn)物免疫印跡的結(jié)果見圖6。由圖6可見,各部份離純化的產(chǎn)物菌能與B7-2單克隆抗體和PEA多抗發(fā)生特異反映，在70kD處顯現(xiàn)明顯的反映帶，而對照菌相應(yīng)位置那么沒

22、有免疫印跡條帶。MTT法檢測特異性殺細(xì)胞活性的結(jié)果MTT的結(jié)果顯示，重組融合蛋白在10ng/ml的劑量下對Jurkat細(xì)胞有顯著的殺傷效應(yīng)，劑量達(dá)到1000ng/ml時其殺傷效率可達(dá)90%,計算其LD50為160ng/ml；而對CD28陰性的Raji細(xì)胞，即即是在2000ng/ml的劑量下也未觀看到任何殺傷效應(yīng)，Raji細(xì)胞生長良好。由此初步證明，咱們所設(shè)計構(gòu)建的全新型重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白對CD28陽性靶細(xì)胞具有選擇性殺傷效應(yīng)（圖7)o人們關(guān)于未知蛋白的純化，通?？捎卸喾N的選擇如有離子互換法、凝膠過濾法、疏水層析法、反相層析法和親和層析法。各類方式有各自的特點，如離子互換是利

23、用不同蛋白質(zhì)在必然pH條件下電荷數(shù)的不同用不同的鹽度從低到高洗脫，一樣堿性蛋白采納陽離子互換,酸性蛋白利用陰離子互換；凝膠過濾法又稱分子篩，即依照蛋白分子量的大小分離，大分子先分出，小分子后分出，可用于脫鹽；疏水層析那么利用蛋白的疏水性，親水性強(qiáng)的蛋白第一流出，疏水性強(qiáng)的后流出，它與離子互換相反，用鹽從高鹽度洗至低鹽度，因此它能夠與離子互換聯(lián)用，用于分離蛋白并脫鹽；反相層析那么是依照蛋白的極性與非極性分離，在這一方式中，反相的流動相通常采納有機(jī)溶劑如甲醇、乙月青及異丙醇。由于蛋白在有機(jī)溶劑中的溶解度一樣較低，容易產(chǎn)生沉淀，變性失活，因此首選用的比較少，但反相層析的分辨率在所有的分離方式中是分辨

24、率最高的；親合層析那么是在所有的純化方式中特異性最強(qiáng)的9。關(guān)于重組細(xì)胞因子外毒素免疫毒素的純化而言，用的較多是離子互換和凝膠過濾方式，采納的分離方式多為陰離子互換，用的互換介質(zhì)大部份為Pharmacia生產(chǎn)的MonoQ介質(zhì)；凝膠過濾那么采納TSK,如Kreitman等10關(guān)于IL6-PE40系列融合蛋白純化即用的此線路,而關(guān)于DAB389-IL2采納反相層析取得了比較好的成效。其他細(xì)胞因子外毒素融合蛋白純化步驟由于未見文獻(xiàn)報導(dǎo)而不知曉11。在最初選用的反相層析分離中，流動相別離采納了常規(guī)的甲醇和乙月青，結(jié)果顯示所分離的該重組融合蛋白均發(fā)生了變性，從色譜柱中分離出來就生成了絮狀沉淀。隨后又采納了

25、染料親和層析，試圖一步分離取得活性產(chǎn)物。但是由于全菌體蛋白中與介質(zhì)發(fā)生非特異結(jié)合的成份較多，極難區(qū)分目的蛋白和雜蛋白。需強(qiáng)調(diào)說明的是，由于PRSETA-B7-2-PE40KDEL表達(dá)載體上帶有翻譯增強(qiáng)序列T7-glO,可在表達(dá)目的蛋白N端融合6個組氨酸，這十分有利于通過金屬螯合層析法快速高純度地純化表達(dá)產(chǎn)物。依照這一特性，經(jīng)反復(fù)挑選精心設(shè)計咱們最終確信組合了金屬螯合層析、陰離子互換層析和凝膠過濾層析組合的三步法的純化線路，用于純化分離B7-2-PE40KDEL融合蛋白。由此純化的目的蛋白的純度可達(dá)95%以上，總回收率為8%。這一純化線路所純化的重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特異性靶向

26、殺傷表達(dá)CD28受體的人T細(xì)胞?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1馮小黎，金業(yè)濤，蘇志國.分離純化中蛋白質(zhì)的不穩(wěn)固性及其計謀.生物工程進(jìn)展，2000；20：67-712唐松山，劉鐘濱.大腸桿菌外源基因表達(dá)產(chǎn)物的下游技術(shù).國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊,1995；18：124-1273RudolphR,LilieH.Invitrofoldingofinclusionbodyproteins.FASEBJ,1996；10:49-564VuillardL,Rabi1loudT,GoldbergME.Interactionsofnon-detergentsulfobetaineswithearlyfoldingintermediatesfacilitateinvitroproteinr