丹酚酸B干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌分化早期基因表達(dá)的影響

1、丹酚酸B干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌分化早期基因表達(dá)的影響 作者：李慶雯 譚俊珍 南亞昀 范英昌【摘要】 目的 探討中藥丹酚酸B預(yù)處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）對(duì)急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向心肌分化早期基因表達(dá)的影響。方法 密度梯度離心法和貼壁篩選法培養(yǎng)、純化EPCs與BMSCs；免疫細(xì)胞化學(xué)法（CD34/CD133/CD44）分別鑒定兩種細(xì)胞。結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈，制作大鼠AMI模型，42只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，BMSCs組，EPCs+BMSCs組，其中治療組用丹酚酸B最佳藥物濃度處理的EPCs與BMSCs混合，在大鼠AMI區(qū)周邊分五點(diǎn)注射。R

2、TPCR檢測心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA4表達(dá)。結(jié)果 細(xì)胞移植4 w后，EPCs+BMSCs組心肌Nkx2.5、GATA4表達(dá)量分別為2.2560.524和1.5670.287，與對(duì)照組比較差異顯著。結(jié)論 丹酚酸B預(yù)處理的EPCs聯(lián)合BMSCs的移植上調(diào)了BMSCs向心肌分化過程中Nkx2.5、GATA4基因的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞的數(shù)量增加有重要影響，從而有可能改善心功能。 【關(guān)鍵詞】 丹酚酸B；急性心肌梗死；內(nèi)皮祖細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞移植【Abstract】 Objective To investigate the effect of salvianolic acid B pr

3、econditioned endothelial progenitor cells combined with bone mesenchymal stem cells on gene expression in rats models of acute myocardial infarction(AMI). Methods Cultivation and purification of EPCs and BMSCs in vitro were by densitygradient centrifugation and plastic adherence method, and were ide

4、ntified by immunofluorescence and immunocytochemistry (CD34/CD133/CD44). The rat model of AMI was produced by ligation of the coronary artery. 42 rats were divided randomly by model, sham, BMSCs and EPCs combined with BMSCs groups, and EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs

5、were injected into the five points of heart ischemia area. After 4 weeks, the expression of Nkx2.5, GATA4 were examined by realtime PCR. Results The expression of NKx2.5 and GATA4mRNA were 1.7000.382 and 1.1350.257 respectively, which increased remarkably compared with control group. Conclusions The

6、 EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs transplantation can increase the expression of NKx2.5 and GATA4, which improve the cardiac function. 【Key words】 Salvianolic acid B (SalB); Endothelial progenitor cells (EPCs); Bone mesenchymal stem Cells (BMSCs); Acute myocardialin in

7、farction (AMI)移植的干細(xì)胞能在受損心肌部位分化成為新的心肌樣細(xì)胞1，2，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）因自體來源，取材容易，擴(kuò)增能力強(qiáng)，成為研究熱點(diǎn)。目前研究主要集中在通過藥物誘導(dǎo)來提高間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植后的存活和定向分化3，4。本文前期的研究結(jié)果表明丹酚酸B(SalB)可以減小心肌梗死的面積5,促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，移植后促進(jìn)缺血性疾病的血管再生和側(cè)支循環(huán)建立已被證明6。因此本文采用SalB預(yù)處理EPCs，與BMSCs聯(lián)合移植，觀察急性心肌梗死（AMI）大鼠模型BMSCs向心肌細(xì)胞分化過程中早期基因Nkx2.5、GATA4的

8、表達(dá)情況。1 資料與方法1.1 材料 LDMEM (美國Gibco公司)；特級(jí)胎牛血清（美國Hyclone公司）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）,堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），纖維連接蛋白(RD公司)；大鼠單個(gè)核細(xì)胞分離液（天津?yàn)螅?CO2恒溫培養(yǎng)箱（model TC2323 CO2 incubator）；CD34兔多克隆抗體，CD44兔多克隆抗體(武漢博士德），CD133兔多克隆抗體（天津?yàn)螅?；SalB（天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，批號(hào)20060601）；ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR(R) Premix Ex TaqTM（寶生物工程（大連）有限公司）；

9、Trizol總RNA提取試劑（天津潤泰科技發(fā)展有限公司）。1.2 方法1.2.1 EPCs培養(yǎng)與鑒定 貼壁培養(yǎng)和密度梯度離心結(jié)合法：雄性Wistar大鼠，脫頸處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，DHank液沖洗骨髓，篩網(wǎng)過濾，將大鼠單個(gè)核細(xì)胞分離液（密度為1.080 g/ml）預(yù)先置于試管的底部，按照11的比例緩慢滴加骨髓懸液，離心（2 000 r/min，15 min），抽取位于界面層灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，用DHank離心洗滌后，以2.0105/cm2的密度接種于纖維連接蛋白(5 g/cm2)的包被的培養(yǎng)瓶中，LDMEM（含體積分?jǐn)?shù)為15%胎牛血清，15%VEGF，15% bFGF），置于37，

10、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后首次換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。選取生長良好的培養(yǎng)至7 d的EPCs，用SABC法檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD133。CD34、CD133定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色、高出背景色者為陽性細(xì)胞。1.2.2 BMSCs培養(yǎng)與鑒定 貼壁培養(yǎng)和密度梯度離心結(jié)合法：雄性Wistar大鼠，脫頸處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，DHank液沖洗骨髓，篩網(wǎng)過濾，將percoll細(xì)胞分離液（密度1.073 g/ml）預(yù)先置于試管的底部，按照11的比例緩慢滴加骨髓懸液，離心（1 800 r/min，20 min），收獲位于界面層灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，用D

11、MEM離心洗滌后以3.0105/cm2的密度接種于DMEM（含10%胎牛血清），置于37，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d更換一次培養(yǎng)液。2 w后，細(xì)胞長滿80%瓶底。BMSCs表達(dá)CD44，但不表達(dá)CD34。1.2.3 MTT方法檢測SalB的最佳藥物濃度 設(shè)立SalB濃度為0，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64 g/ml共10組，MTT方法分別測定細(xì)胞的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值均數(shù)確定SalB的最佳藥物濃度。1.2.4 大鼠AMI模型的制作 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法，乙醚麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，頸部胸部備皮、消毒，鋪無菌孔巾，在胸部左側(cè)約

12、0.5 cm處第4、5肋間切開皮膚，剪開心包，暴露心臟，以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，在左心耳根部下方2 mm結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)記錄心電圖。術(shù)后15 min心電圖T波高尖、ST段顯著抬高標(biāo)志結(jié)扎成功。1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 42只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk20050001）。體重230270 g，心梗造模成功后，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，BMSCs組，EPCs+BMSCs組。其中假手術(shù)組，只開胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈；模型組開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，注射細(xì)胞培養(yǎng)液。BMSCs組注射正常培養(yǎng)的BMSCs 500 l，EPCs+BM

13、SCs組SalB預(yù)處理EPCs后與BMSCs混合注射。1.2.6 細(xì)胞移植 獲取細(xì)胞混懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度：BMSCs濃度為1107/ml；SalB最佳藥物濃度處理的EPCs濃度分別調(diào)整成1105。治療組手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)15 min后，再次打開胸腔，暴露心臟，用結(jié)核菌素注射器分別吸取250 l BMSCs細(xì)胞懸液和250 l SalB預(yù)處理的EPCs細(xì)胞懸液（BMSCs組只吸取500 l BMSCs細(xì)胞懸液），分別于結(jié)扎區(qū)附近心肌組織分5點(diǎn)注射細(xì)胞，模型組注射同劑量細(xì)胞培養(yǎng)液。1.2.7 BMSCs心肌Nkx2.5、GATA4基因表達(dá)的檢測 4 w后，各組大鼠脫頸處死，迅速取心臟組織，置于液氮-7

14、0冰箱保存，檢測組織mRNA的表達(dá)。RTPCR法。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以xs表示，SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差進(jìn)行組間比較。x【摘要】 目的 探討中藥丹酚酸B預(yù)處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）對(duì)急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向心肌分化早期基因表達(dá)的影響。方法 密度梯度離心法和貼壁篩選法培養(yǎng)、純化EPCs與BMSCs；免疫細(xì)胞化學(xué)法（CD34/CD133/CD44）分別鑒定兩種細(xì)胞。結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈，制作大鼠AMI模型，42只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，BMSCs組，EPCs+BMSCs組，其中治療組用丹酚酸B最佳藥物濃度處理的EPCs與BMSCs混

15、合，在大鼠AMI區(qū)周邊分五點(diǎn)注射。RTPCR檢測心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA4表達(dá)。結(jié)果 細(xì)胞移植4 w后，EPCs+BMSCs組心肌Nkx2.5、GATA4表達(dá)量分別為2.2560.524和1.5670.287，與對(duì)照組比較差異顯著。結(jié)論 丹酚酸B預(yù)處理的EPCs聯(lián)合BMSCs的移植上調(diào)了BMSCs向心肌分化過程中Nkx2.5、GATA4基因的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞的數(shù)量增加有重要影響，從而有可能改善心功能。 【關(guān)鍵詞】 丹酚酸B；急性心肌梗死；內(nèi)皮祖細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞移植【Abstract】 Objective To investigate the effect of sal

16、vianolic acid B preconditioned endothelial progenitor cells combined with bone mesenchymal stem cells on gene expression in rats models of acute myocardial infarction(AMI). Methods Cultivation and purification of EPCs and BMSCs in vitro were by densitygradient centrifugation and plastic adherence me

17、thod, and were identified by immunofluorescence and immunocytochemistry (CD34/CD133/CD44). The rat model of AMI was produced by ligation of the coronary artery. 42 rats were divided randomly by model, sham, BMSCs and EPCs combined with BMSCs groups, and EPCs preconditioned with salvianolic acid B co

18、mbined with BMSCs were injected into the five points of heart ischemia area. After 4 weeks, the expression of Nkx2.5, GATA4 were examined by realtime PCR. Results The expression of NKx2.5 and GATA4mRNA were 1.7000.382 and 1.1350.257 respectively, which increased remarkably compared with control grou

19、p. Conclusions The EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs transplantation can increase the expression of NKx2.5 and GATA4, which improve the cardiac function. 【Key words】 Salvianolic acid B (SalB); Endothelial progenitor cells (EPCs); Bone mesenchymal stem Cells (BMSCs); Acu

20、te myocardialin infarction (AMI)移植的干細(xì)胞能在受損心肌部位分化成為新的心肌樣細(xì)胞1，2，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）因自體來源，取材容易，擴(kuò)增能力強(qiáng)，成為研究熱點(diǎn)。目前研究主要集中在通過藥物誘導(dǎo)來提高間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植后的存活和定向分化3，4。本文前期的研究結(jié)果表明丹酚酸B(SalB)可以減小心肌梗死的面積5,促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，移植后促進(jìn)缺血性疾病的血管再生和側(cè)支循環(huán)建立已被證明6。因此本文采用SalB預(yù)處理EPCs，與BMSCs聯(lián)合移植，觀察急性心肌梗死（AMI）大鼠模型BMSCs向心肌細(xì)胞分化過程

21、中早期基因Nkx2.5、GATA4的表達(dá)情況。1 資料與方法1.1 材料 LDMEM (美國Gibco公司)；特級(jí)胎牛血清（美國Hyclone公司）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）,堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），纖維連接蛋白(RD公司)；大鼠單個(gè)核細(xì)胞分離液（天津?yàn)螅?CO2恒溫培養(yǎng)箱（model TC2323 CO2 incubator）；CD34兔多克隆抗體，CD44兔多克隆抗體(武漢博士德），CD133兔多克隆抗體（天津?yàn)螅?；SalB（天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，批號(hào)20060601）；ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR(R) Premix Ex Taq

22、TM（寶生物工程（大連）有限公司）；Trizol總RNA提取試劑（天津潤泰科技發(fā)展有限公司）。1.2 方法1.2.1 EPCs培養(yǎng)與鑒定 貼壁培養(yǎng)和密度梯度離心結(jié)合法：雄性Wistar大鼠，脫頸處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，DHank液沖洗骨髓，篩網(wǎng)過濾，將大鼠單個(gè)核細(xì)胞分離液（密度為1.080 g/ml）預(yù)先置于試管的底部，按照11的比例緩慢滴加骨髓懸液，離心（2 000 r/min，15 min），抽取位于界面層灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，用DHank離心洗滌后，以2.0105/cm2的密度接種于纖維連接蛋白(5 g/cm2)的包被的培養(yǎng)瓶中，LDMEM（含體積分?jǐn)?shù)為15%胎牛血清，15%VE

23、GF，15% bFGF），置于37，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后首次換液，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。選取生長良好的培養(yǎng)至7 d的EPCs，用SABC法檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD133。CD34、CD133定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色、高出背景色者為陽性細(xì)胞。1.2.2 BMSCs培養(yǎng)與鑒定 貼壁培養(yǎng)和密度梯度離心結(jié)合法：雄性Wistar大鼠，脫頸處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，DHank液沖洗骨髓，篩網(wǎng)過濾，將percoll細(xì)胞分離液（密度1.073 g/ml）預(yù)先置于試管的底部，按照11的比例緩慢滴加骨髓懸液，離心（1 800 r/min，20 min），收獲位于界面層灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，用DMEM離心洗滌后以3.0105/cm2的密度接種于DMEM（含10%胎牛血清），置于37，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d更換一次培養(yǎng)液。2 w后，細(xì)胞長滿80%瓶底。BMSCs表達(dá)CD44，但不表達(dá)CD34。1.2.3 MTT方法檢測SalB的最佳藥物濃度 設(shè)立SalB濃度為0，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64 g/m