Rapamycin和cyclosporinA對(duì)同種排斥過程中TLR5及Foxp3表達(dá)的影響

1、Rapamycin和cyclosporin A對(duì)同種排斥過程中TLR5及Foxp3表達(dá)的影響 作者：陳富強(qiáng), 曲莉莉, 張超, 梁婷, 宋靜, 徐佳, 侯桂華【摘要】 目的: 研究雷帕霉素（Rapamycin, RAPA）和環(huán)孢素A（cyclosporin A, CsA）體內(nèi)處理對(duì)同種移植小鼠急性排斥過程中TLR5及Foxp3表達(dá)的影響。方法: 建立同種皮膚移植模型, 術(shù)后給予RAPA或CsA, 1次/d, 連續(xù)14 d, 同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。每日觀察移植物存活狀況。術(shù)后選取1、 7、 10、 14、 21 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn), 提取受體小鼠脾細(xì)胞, RTPCR檢測(cè)TLR5及Foxp3 mRNA

2、表達(dá), 探討不同處理組基因表達(dá)與移植物生存的相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)利用鞭毛蛋白（flagellin）聯(lián)合RAPA和CsA處理正常小鼠T細(xì)胞6 h, RTPCR檢測(cè)TLR5表達(dá)。結(jié)果: RAPA和CsA可明顯延長(zhǎng)小鼠同種移植皮片存活期。RAPA可促進(jìn)脾細(xì)胞TLR5 mRNA表達(dá)升高, 停藥后的第21天仍明顯高于CsA組和對(duì)照組（P0.05）; CsA組在第7、 10天有顯著升高, 第21天降低（P0.05）; 3組中最高表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)為移植后第10天, 此時(shí)正值排斥高峰期。RAPA可引起Foxp3 mRNA的表達(dá)升高（P0.05）, 停藥后仍維持較高水平; CsA組僅在移植后第7、 10天短暫升高, 第

3、14天低于對(duì)照組（P0.05）。移植后1、 7、 10、 21 d 3組的TLR5與Foxp3 mRNA變化趨勢(shì)正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中, RAPA或CsA與flagellin聯(lián)合使用, 可促進(jìn)TLR5的表達(dá), 以前者的作用更為明顯。結(jié)論: RAPA和CsA在同種移植急性排斥高峰期可引起TLR5和Foxp3表達(dá)的協(xié)同升高, 且RAPA的作用更加明顯和持久, 鞭毛蛋白體外可以增強(qiáng)這種作用效果。 【關(guān)鍵詞】 雷帕霉素; 環(huán)孢素A; 同種移植; TLR5; Foxp3; 鞭毛蛋白CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在維持外周免疫耐受, 調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答, 預(yù)防移植排斥中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子Foxp

4、3是Treg的特征性標(biāo)志, 對(duì)其功能的誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用。研究證實(shí)Treg高表達(dá)TLR4、 TLR5、 TLR7和TLR8, 其中TLR5活化能夠增強(qiáng)Treg細(xì)胞抑制功能, 同時(shí)可使Foxp3表達(dá)增加, TLR5的特異配體鞭毛蛋白可增強(qiáng)Treg對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用。但是同種移植狀態(tài)下, TLR5的表達(dá)狀況及移植物生存關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。研究移植排斥過程中TLRs對(duì)Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制, 對(duì)探討Treg的免疫抑制機(jī)制以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的意義。 免疫抑制藥物雷帕霉素 (Rapamycin, RAPA)和環(huán)胞素A(cyclosporin A, CsA)廣泛用于器官移植后抗移植物排斥反應(yīng), 并

5、且在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶鳛檎T導(dǎo)免疫耐受的工具。目前使用的免疫抑制藥物可以通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的擴(kuò)增防止移植物的排斥, 但是是否可以誘導(dǎo)激活Treg細(xì)胞以及其分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步闡明。CsA抑制TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活和IL2的產(chǎn)生, 而RAPA阻斷T細(xì)胞生長(zhǎng)因子細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 因此 CsA和RAPA對(duì)CD4+CD25+Treg可能有不同的作用1。研究表明RAPA在體外可以選擇性地?cái)U(kuò)增CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞, 而不阻斷其他類型T細(xì)胞的擴(kuò)增和活化, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡2。 我們前期的研究證實(shí)RAPA和CsA體內(nèi)處理可以明顯增加同種移植受體的Treg比例, 增強(qiáng)Foxp3的表達(dá)。但是即使體內(nèi)使用RAPA,

6、 同種移植個(gè)體中的Treg比例仍然處于較低水平3。如何通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞活性, 在體內(nèi)擴(kuò)增Treg細(xì)胞, 更好地誘導(dǎo)同種移植耐受仍是亟待解決的問題。2008年有研究報(bào)告4, 體內(nèi)給予TLR5特異配體flagellin, 可以保護(hù)機(jī)體免受化學(xué)、 病毒和輻射等損害。鑒于TLR5的表達(dá)有助于免疫保護(hù)的形成, 我們推測(cè)同種移植個(gè)體的TLR5的活化可能有助于Treg的激活和移植耐受的形成。因此利用RAPA和CsA處理小鼠同種移植模型, 研究急性排斥過程中體內(nèi)TLR5及Foxp3表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì), 探討在急性同種移植排斥過程中TLR5和Foxp3表達(dá)與移植物生存的關(guān)系及兩種抗排斥藥物的作用, 旨在為

7、利用TLR5特異配體和RAPA進(jìn)行同種移植耐受誘導(dǎo)奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 BALB/c小鼠(H2d), 由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; C57BL/6 (H2b, B6)小鼠, 由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。以上小鼠均為雌性, 812周齡, 均飼養(yǎng)在恒溫(2527)、 恒定濕度(45%55%)無特殊病原菌(SPF級(jí))環(huán)境中。RAPA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司, CsA 購(gòu)自Novartis Pharama公司, RTPCR及PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司, Foxp3、 TLR5引物及GAPDH引物由博尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。副傷寒桿菌鞭毛蛋白flagellin (本室參照文獻(xiàn)5制備）

8、。12 方法121 小鼠同種移植模型制備 參照文獻(xiàn)6進(jìn)行。制備全厚度小鼠軀干皮膚移植物并行移植術(shù)。脫椎法處死供體小鼠（B6）, 取全厚度軀干部皮膚, 去除皮下脂肪及血管, 剪成1 cm2大小的皮片備用。然后給受體BALB/c小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 g/g體質(zhì)量）行麻醉術(shù), 在小鼠右背部制備移植床, 將供體皮片置于移植床, 包扎固定后逐日觀察移植物排斥狀況。當(dāng)移植皮片壞死達(dá)50%時(shí), 即為完全排斥。122 實(shí)驗(yàn)分組及模型的耐受誘導(dǎo) 將移植過皮片的BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組, 每組15只。對(duì)照組: 術(shù)后腹腔注射生理鹽水, 0.2 mL/只, 連續(xù)14 d; CsA處理組: 術(shù)后注射CsA,

9、 10 mg/(kg·d), 連續(xù)14 d; RAPA處理組: 術(shù)后腹腔注射RAPA, 1.5 mg/(kg·d), 連續(xù)14 d（此時(shí)對(duì)照組移植皮片全部排斥掉, 故停藥）。123 TLR5及Foxp3 mRNA的表達(dá) 分別于移植后第1、 7、 10、 14、 21天, 取實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組小鼠脾臟, 提取脾細(xì)胞, 采用異硫基氫酸胍（TRIzol）一步法提取細(xì)胞總RNA, 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增, 以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參對(duì)照。1 TAE制備15 g/L的瓊脂糖凝膠, 加入濃度為0.5 mg/L的溴化乙啶（EB）染色。取PCR反

10、應(yīng)產(chǎn)物10 L與2 L上樣緩沖液混合后點(diǎn)樣于凝膠孔電泳, 以相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）2 000的Marker做標(biāo)準(zhǔn)判斷PCR產(chǎn)物片段大小, 恒壓5 V/cm電泳50 min, 然后用凝膠掃描儀在A260波長(zhǎng)紫外光下觀察并掃描。用FR200UV/WHITE ANALYSIS及Photo Impact SE系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果作圖像分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以檢測(cè)條帶與GAPDH條帶的總灰度值的比值作為待測(cè)目的片段的相對(duì)值。124 flagellin聯(lián)合RAPA、 CsA體外處理對(duì)TLR5的影響 通過小鼠T淋巴細(xì)胞純化柱（Mouse T Cell Enrichment Columns）純化BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞,

11、106/孔接種于24孔培養(yǎng)板上; 加入B6小鼠可溶性同種抗原6, 實(shí)驗(yàn)分6組: 對(duì)照組（不加任何藥物處理）、 flagellin組（100 g/L）、 RAPA（15 mg/L）組, CsA組（15 mg/L）, flagellin（100 g/L）+RAPA（15 mg/L）組、 flagellin（100 g/L）+ CsA組（15 mg/L）; 每組3個(gè)復(fù)孔, 37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞, RTPCR檢測(cè)TLR5表達(dá)量, 用FR200UV/WHITE ANALYSIS及Photo Impact SE系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果作圖像分析, 以檢測(cè)條帶與GAPDH條帶的總

12、灰度值的比值作為待測(cè)目的片段的相對(duì)值。125 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以x±s表示, 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析, P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果21 RAPA及CsA對(duì)同種移植皮片存活時(shí)間的影響 與對(duì)照組（13.2±1.5 d）相比, 雷帕霉素組（22.8±2.1 d）和CsA組(22.0±1.9 d)移植皮片的存活時(shí)間均明顯延長(zhǎng), 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, 圖1)。雷帕霉素組和CsA組間雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 但CsA組小鼠一般生存狀態(tài)較差。22 RAPA及CsA誘導(dǎo)對(duì)TLR5及Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

13、（1）TLR5 mRNA表達(dá)狀況: 如圖2所示, 與對(duì)照組相比, 同種移植后, 特別是第1、 7、 10、 21天, RAPA體內(nèi)處理組脾細(xì)胞TLR5 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P0.05）。而CsA處理組的TLR5表達(dá)在第7、 10天有明顯升高, 第21天明顯下降。此時(shí)低于對(duì)照組（P0.05）。3組中的TLR5 mRNA表達(dá)最高的時(shí)間點(diǎn)是同種移植后第10天, 此時(shí)正值排斥高峰期。（2）Foxp3 mRNA的表達(dá)變化: 未處理組同種移植后第10天Foxp3表達(dá)顯著升高, 此后迅速下降, 第14天恢復(fù)至正常水平（圖3）。CsA組移植后第7天開始升高, 第10天達(dá)到高峰（P0.05）, 第14天明顯下

14、降; RAPA組移植后第1天的Foxp3表達(dá)明顯升高, 第10、 14天達(dá)到高峰（P0.05）, 第21天仍明顯高于未處理組和CsA組; 移植后第7天, 第10天的RAPA組和CsA組的Foxp3表達(dá)無顯著差異（P0.05）。但是CsA組移植后第14天Foxp3表達(dá)較RAPA組顯著下降（P0.05）。結(jié)果提示RAPA處理組的Foxp3表達(dá)持續(xù)升高可能是其延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間的機(jī)制之一。圖1 RAPA和CsA對(duì)同種移植皮片存活時(shí)間的影響（略）Fig 1 Effect of RAPA and CsA on the survival time of allograft圖2 RAPA和CsA對(duì)同種移植受

15、體TLR5 mRNA表達(dá)的影響（略）Fig 2 Effect of RAPA/CsA on the expression of TLR5 mRNAaP0.05 vs control.23 TLR5與Foxp3基因表達(dá)的相關(guān)性 如圖4所示, 同種移植后TLR5和Foxp3的表達(dá)均在排斥高峰期（移植后第10天）升高最明顯, 之后Foxp3的表達(dá)迅速下降, 而TLR5的表達(dá)持續(xù)移植后14 d才開始下降。而體內(nèi)給予CsA后, TLR5和Foxp3的表達(dá)第7天就明顯升高, 第10天達(dá)到高峰, Foxp3在第14天恢復(fù)至起始水平, 而TLR5在第21天恢復(fù)至起始水平（圖5）; RAPA體內(nèi)處理組的TLR5

16、和Foxp3的表達(dá)從移植后就開始同步升高, 第10天達(dá)到高峰, 第21天恢復(fù)至初始水平（圖6）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示, 小鼠皮片急性移植排斥期1、 7、 10、 21 d, 移植受體脾細(xì)胞的TLR5與Foxp3變化趨勢(shì)明顯正相關(guān), 且免疫抑制藥物CsA與RAPA均顯著上調(diào)它們的表達(dá), RAPA上調(diào)效果最為明顯。圖3 RAPA和CsA對(duì)同種移植個(gè)體Foxp3 mRNA表達(dá)的影響（略）Fig 3 Effect of RAPA/CsA on the expression of Foxp3 mRNAaP0.05 vs control.圖4 同種移植排斥過程中TLR5與Foxp3基因表達(dá)的相關(guān)性（略）Fig

17、4 Relationship of TLR5 and Foxp3 mRNA expression during allorejection圖5 CsA 對(duì)同種移植排斥過程中TLR5與Foxp3基因表達(dá)的影響（略）Fig 5 Effect of CsA on expression of TLR5 and Foxp3 mRNA during allorejection24 T細(xì)胞體外培養(yǎng)后TLR5的表達(dá) 與對(duì)照粗相比, 小鼠脾T細(xì)胞體外培養(yǎng)6 h后, flagellin處理組、 flagellin+RAPA聯(lián)合處理組、 flagellin+CsA聯(lián)合處理組的TLR5 mRNA均明顯高表達(dá)（P0.0

18、5）, 其中flagellin+RAPA聯(lián)合處理組增高更明顯, 而單獨(dú)用CsA處理、 RAPA處理組的TLR5 mRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖6 RAPA對(duì)同種移植排斥過程中TLR5與Foxp3基因表達(dá)的影響（略）Fig 6 Effect of RAPA on expression of TLR5 and Foxp3 mRNA during allorejection圖7 flagellin, RAPA和CsA對(duì)小鼠T細(xì)胞TLR5表達(dá)的影響（略）Fig 7 Effect of flagellin, RAPA and CsA on expression of TLR5 of T cellsaP0.05

19、 vs control.3 討論 迄今為止發(fā)現(xiàn)的TLRs家族多數(shù)對(duì)免疫應(yīng)答起激活增強(qiáng)作用, 如TLR2、 TLR4等, 而TLR5作為一種特殊的TLRs, 對(duì)免疫應(yīng)答具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。目前發(fā)現(xiàn)TLR5的唯一配體是細(xì)菌鞭毛蛋白（flagellin）。因此選擇TLR5, 研究其在同種移植排斥中的表達(dá)及意義, 可以為利用flagellin誘導(dǎo)移植耐受奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨著近年來對(duì)Treg作用機(jī)制研究的日益深入, 越來越多的證據(jù)證實(shí)在機(jī)體正常及疾病狀態(tài)下, 病原相關(guān)分子模式（PAMPs）可通過Toll樣受體調(diào)節(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖及功能。如, TLR2缺陷小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)

20、量明顯減少, 且TLR2的配體能夠在體外培養(yǎng)中促進(jìn)其增殖, 表明TLR2對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增和和抑制活性的維持非常重要; 小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞選擇性的高水平表達(dá)TLR1、 2、 4、 5、 7和8, 且LPS可與CD4+CD25+Treg上TLR4結(jié)合增強(qiáng)Treg細(xì)胞抑制能力, 小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面TLR4的配體能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抑制能力; 與此不同的是TLR8的配體能夠直接作用于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞, 并降低其抑制能力7。因此, 不同TLRs對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有不同作用。CD4+CD25+T細(xì)胞高表達(dá)TLR4及TLR5 mRNA, 作為

21、一種協(xié)同刺激分子, TLR5可能通過影響Foxp3的表達(dá)而增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制能力。 CsA和RAPA都是臨床器官移植患者的常用藥, 可以減少免疫細(xì)胞的增殖和活化, 進(jìn)而抑制移植排斥反應(yīng)。二者聯(lián)合使用能減少腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率, 然而這兩種藥物對(duì)Treg的影響卻不同。腎移植病人, 術(shù)后使用RAPA, 體內(nèi)Treg的比例與健康人無顯著差異, 明顯高于術(shù)后使用CsA組8。 本研究證實(shí), 同種移植急性排斥高峰期, TLR5和Foxp3表達(dá)升高, 給予CsA與RAPA, 對(duì)移植受體TLR5和Foxp3表達(dá)的影響不同, 二者雖然都可引起移植排斥高峰期的TLR5和Foxp3表

22、達(dá)升高, 但RAPA作用更強(qiáng), 尤其是引起Foxp3表達(dá)持續(xù)升高, CsA也可促進(jìn)這兩種基因的表達(dá), 但持續(xù)時(shí)間較短。提示RAPA抗移植排斥的機(jī)理之一可能是通過激活Treg發(fā)揮作用。體外研究結(jié)果提示, flagellin可以激活T細(xì)胞的TLR5表達(dá), RAPA可以加強(qiáng)這一作用, 因此有望利用flagellin聯(lián)合RAPA進(jìn)行移植耐受的誘導(dǎo)。至于flagellin通過什么樣的信號(hào)途徑, 其與RAPA作用途徑是否有交叉, 及相互影響的進(jìn)一步意義等, 這些誘人的問題尚待研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Coenen JJ, Koenen HJ, van Rijssen E, et al. Rapamycin,

23、 and not cyclosporin A, preserves the highly suppressive CD27+ subset of human CD4+CD25+ regulatory T cellsJ. Blood, 2006, 107(3): 1018-1023.2 Battagia M, Stabilini A, Roncarolo MG, et al. Rapamycin selectively expands CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cellsJ. Blood, 2005, 105(15): 4743-4748.3 鄭永先, 侯桂華, 宋 靜, 等 雷帕霉素對(duì)同種移植耐受模型CD4+CD25+T細(xì)胞活性的影響J 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2007, 23（4）: 327-3304 VijayKumar M, Aitken JD