汞脅迫對(duì)桐花樹幼苗根和葉蛋白質(zhì)功能的影響

1、汞脅迫對(duì)桐花樹幼苗根和葉蛋白質(zhì)功能的影響設(shè)計(jì)方案目錄：1. 研究現(xiàn)狀2. 研究目標(biāo)3. 研究方案 3.1 基本生理指標(biāo)的測(cè)定 3.1.1丙二醛（MDA）的測(cè)定 3.1.2 還原糖的測(cè)定 3.1.3 葉綠素的測(cè)定 3.1.4 谷胱甘肽（GSH）的測(cè)定 3.1.5 過氧化物酶（POD）的測(cè)定 3.1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定 3.1.7 過氧化氫酶（CAT）的測(cè)定 3.1.8 總汞的測(cè)定 3.2 蛋白質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定 3.2.1 超薄切片制作及電鏡觀察 3.2.2可溶性蛋白含量測(cè)定 3.2.3 蛋白的層析分析 3.2.4 非蛋白巰基（non-protein thiol，NPT）含量的測(cè)定 3

2、.2.5 細(xì)胞可溶部分Hg的分子分布4. 經(jīng)費(fèi)預(yù)算參考文獻(xiàn)1. 研究現(xiàn)狀 紅樹林是指自然分布于熱帶亞熱帶海陸交匯的潮間帶木本植物群落，是海灘上特有的森林類型, 紅樹植物是該生態(tài)系統(tǒng)各級(jí)消費(fèi)者物質(zhì)和能量的主要來源，對(duì)維護(hù)生態(tài)平衡，保護(hù)海岸生態(tài)系統(tǒng)起著重要的作用(林鵬等，1995；林鵬，1997)。紅樹植物是熱帶、亞熱帶海灣河口優(yōu)勢(shì)植物種, 是該生態(tài)系統(tǒng)的重要初級(jí)生產(chǎn)者, 對(duì)維護(hù)海灣河口地區(qū)的生態(tài)平衡起著十分重要的作用。近年來，隨著江河流域工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，沿海城市人口與經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，大量排放的污染物匯集于河口、海灣區(qū)，從而使重金屬污染日趨嚴(yán)重。汞是一種極毒的重金屬元素, 其毒性位于各金屬之首。汞分為無

3、機(jī)汞和有機(jī)汞兩大類, 后者的毒性比前者更大。當(dāng)植物體中汞的積累濃度達(dá)到一定范圍后, 它就會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（解凱彬等，2000；李大輝等，1999；施國(guó)新等，2000；郝懷慶，2001），輕則使植物體內(nèi)代謝過程發(fā)生紊亂, 生長(zhǎng)發(fā)育受阻, 重則可造成植物枯萎, 甚至衰老死亡（張義賢，1997）。由于它極易經(jīng)大氣、水源和土壤進(jìn)入植物體內(nèi), 然后再通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物和人體中, 對(duì)其造成極大的毒危害, 有的甚至能引起人的神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷, 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的致畸、致癌和致突變活性。桐花樹（Aegiceras corniculatum）是具有一定的耐鹽和泌鹽性紅樹植物，也是我國(guó)分布最廣的紅樹樹種之一（高桂娟

4、等，2009）。本文以紅樹植物桐花為材料，觀察其在不同Hg濃度脅迫下的生理生態(tài)變化，以及葉、根細(xì)胞中蛋白質(zhì)的適應(yīng)性變化，為揭示紅樹植物的耐Hg機(jī)制提供一些理論和實(shí)踐依據(jù)。2. 研究目標(biāo) 紅樹林作為一種海岸潮間帶森林生態(tài)系統(tǒng), 對(duì)海灣河口區(qū)域的污染具有較高承載力和耐受性。目前，在紅樹植物對(duì)重金屬污染響應(yīng)方面的研究主要集中于紅樹植物對(duì)重金屬的富集以及生長(zhǎng)、形態(tài)和生理學(xué)方面, 對(duì)紅樹植物抗污染脅迫的分子機(jī)理方面的研究還極少有報(bào)道。分子生物學(xué)和生態(tài)學(xué)原理的結(jié)合, 為污染生態(tài)學(xué)的研究開辟了一個(gè)廣闊的研究領(lǐng)域（李裕紅，章幼玉，2007）。 本實(shí)驗(yàn)以紅樹植物桐花為材料，觀察其在不同Hg濃度脅迫下的生理生態(tài)變

5、化，以及葉、根細(xì)胞中蛋白質(zhì)的適應(yīng)性變化，為解釋紅樹植物的耐Hg機(jī)制提供一些理論和實(shí)踐依據(jù)。在蛋白質(zhì)水平探討紅樹植物對(duì)重金屬具較高耐受性的分子生態(tài)機(jī)理, 可能發(fā)現(xiàn)在紅樹植物中普遍存在的高效的重金屬結(jié)合物質(zhì)及其控制基因, 可為汞污染的植物生理學(xué)監(jiān)測(cè)提供理論基礎(chǔ)，也可為研究紅樹植物抗重金屬污染機(jī)制及紅樹林生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐依據(jù)。3. 研究方案挑選當(dāng)年生株高約2030 cm，45對(duì)葉片，且生活力強(qiáng)，無病蟲害，大小相近的桐花樹（Aegiceras corniculatum）幼苗進(jìn)行試驗(yàn)。首先進(jìn)行水培，加1/4 Hogland營(yíng)養(yǎng)液于實(shí)驗(yàn)室外自然光下復(fù)壯一周（室溫約25 ），準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。復(fù)壯后

6、，幼苗用自來水沖洗干凈并用超純水沖洗3遍后進(jìn)行不同濃度的Hg（0、0.2、1、10、50 ppm）脅迫處理，脅迫液為HgCl2溶液和1/4 Hogland營(yíng)養(yǎng)液的混合液。每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)56株幼苗。5天后分別取5種脅迫濃度的秋茄幼苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.1 基本生理指標(biāo)的測(cè)定3.1.1丙二醛（MDA）的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法測(cè)定秋茄葉片和根的MDA含量。參照趙世杰等方法，選取新鮮成熟葉，去除中脈剪碎混勻稱取0.5 g樣品，加入3 mL 10TCA和少量石英砂，研磨至勻漿移至15 mL離心管；再加入2 mL 10TCA將研缽中的殘?jiān)慈腚x心管。勻漿在4000 r/min離心10 min。測(cè)定：取上

7、清液2 mL（對(duì)照組2 mL H2O）于新的15 mL離心管中，加入2 mL 0.6%TBA（用10%三氯乙酸配制）混勻，離心管蓋子擰緊?；旌衔镉诜兴≈蟹兄?5 min，迅速冷卻后在4000 rpm，4，離心20 min。取上清液測(cè)定OD532、OD450。計(jì)算：提取液中MDA的含量C(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450然后計(jì)算每克樣品中MDA含量3.1.2 還原糖的測(cè)定采用蒽酮比色法（李合生，2000）測(cè)定秋茄葉片的可溶性糖含量。稱取干樣0.05000.1000 g(0.05000.0700 g），分別加入15 mL刻度離心管中；加蒸餾水10 mL，置沸水浴中提取30

8、min，冷卻離心，上清液倒入50 mL PE瓶中，再往離心管中加10 mL蒸餾水，置沸水浴第二次浸提，上清液倒入PE瓶中，向瓶中加入蒸餾水至50 mL左右，稱重。吸取測(cè)定液0.5 mL于大試管中，加蒸餾水搖勻，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯，放入波長(zhǎng)630 nm的分光光度計(jì)中比色。結(jié)果計(jì)算：可溶性糖測(cè)定液糖含量(g)×10-6/干樣重(g)×分取倍數(shù)×1003.1.3 葉綠素的測(cè)定 參照張憲政（張憲政，1986）的乙醇-丙酮混合液法略有改進(jìn)。選取新鮮成熟葉片，去除中脈剪碎混勻稱取0.10.2 g葉片。等體積乙醇、丙酮混合液10 mL浸泡（乙醇：丙酮：水=4.5：4.

9、5：1），并用保鮮膜封口防止提取液揮發(fā)，置于陰暗處并定期震蕩。浸泡至組織變白后，使用紫外分光光度計(jì)分別于波長(zhǎng)663 nm、645 nm處測(cè)定其抽提液的OD值。根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素含量：Ca=12.7×OD6632.69×OD645 (2.1) Cb=22.9×OD6454.86×OD663 (2.2)Ca+b=8.02×OD663+20.20×OD645 (2.3)葉綠體色素的含量= （mg/g）（C為葉綠素濃度，以g/mL表示）3.1.4 谷胱甘肽（GSH）的測(cè)定（1） 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管編號(hào)，按下表加入各種試劑，混

10、勻，25保溫反應(yīng)10 min。以0號(hào)管為參比調(diào)零，測(cè)定顯色液在波長(zhǎng)412 nm 處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，還原型谷胱甘肽物質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表 1 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)各試劑加入量試管號(hào)100mol/L還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)液/ml蒸餾水/mL0.1mol/L PH7.7磷酸緩沖液0.1mol/L PH7.7磷酸緩沖液相當(dāng)于還原型谷胱甘肽物質(zhì)的量/mol001.01.00.5010.20.81.00.52020.40.61.00.54030.60.41.00.56040.80.21.00.58051.001.00.5100（2） 提取 稱取1 g 樣品于研缽中，加入5 mL 經(jīng)4

11、預(yù)冷的50 g/L三氯乙酸溶液（含5 mmol/LNa2-EDTA），在冰浴條件下研磨成勻漿，于4、19000 g離心15 min（15 mL離心管）。收集上清液用來測(cè)定谷胱甘肽含量，測(cè)量提取液總體積（V？）（3） 谷胱甘肽的測(cè)定 GSH測(cè)定液的制備：將液氮固定的鮮樣組織放于研缽中，加入一定量的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（含0.005 mol/L EDTA）（PH 8.0）和25%偏磷酸（HPO3），并加少量石英砂，冰浴上充分研磨，冷凍離心（4，18000 g 15 min），上清液冷藏用于GSH的測(cè)定。GSH測(cè)定采用熒光分光光度法，參照Gupta等和Hissin等的方法（？）。 測(cè)定：取

12、1支5 mL離心管，依次加入1 mL蒸餾水、1 mL0.1 mol/L磷酸緩沖液（PH7.7）和0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液，混勻，即為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)管液。以此溶液作為參比，在波長(zhǎng)412 nm處對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零。另取2支試管，分別加入1 mL（Vs）上清液、1 mlL0.1 mol/L磷酸緩沖液（PH7.7）。向一支試管中加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液，另一支試管加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（PH6.8）。將兩支反應(yīng)管置于25保溫10 min。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，迅速測(cè)定顯色液在波長(zhǎng)412 nm處的吸光度，分別記做ODS和ODC。（4

13、）結(jié)果計(jì)算 顯色反應(yīng)后，分別記錄樣品管反應(yīng)混合液的吸光度（ODS）和空白對(duì)照管反應(yīng)混合液的吸光度（ODC）。根據(jù)吸光度差值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原型谷胱甘肽量（n），計(jì)算其含量（mol/g）。還原性谷胱甘肽含量（mol/g）=（n×V）/（Vs×m）其中：m為樣品質(zhì)量3.1.5 過氧化物酶（POD）的測(cè)定（1）原理：采用愈創(chuàng)木酚法（劉祖祺，張石城, 1994？）測(cè)定POD過氧化物酶。以每分鐘內(nèi) A470 變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位（U）。POD活性=A470×1000/P×V×0.01u/mg Pro （2.7)其中：A470-1

14、 min內(nèi)吸光度的變化； P-蛋白濃度，g/mL； V-取用酶液體積，mL。（2）試劑：反應(yīng)混合液：100 mmol/L磷酸緩沖液（PH6.0）50 mL，加入愈創(chuàng)木酚28 mL，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19 mL，混合均勻，保存于冰箱中。（3）試驗(yàn)步驟： 粗酶液提取：稱植物葉片0.5 g于研缽中分次加入0.05 mol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液5 mL以及少量（1 mL）的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴下，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，再用4ml緩沖液清洗研缽中的殘?jiān)?。勻漿在高速冷凍離心機(jī)上419000或4000 r/min（最大離心率）

15、離心10 min,收集的酶液用于活性測(cè)定。（提取的酶液即為10 mL） 酶活性的測(cè)定：取光徑1 cm比色皿2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3.9 mL，KH2PO4 0.1 mL，作為校零對(duì)照，另一只中加入反應(yīng)混合液3.9 mL，酶液 0.1 mL，立即開啟秒表計(jì)時(shí)，于分光光度計(jì)470 nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值，每隔1 min讀數(shù)一次。以每分鐘OD變化值表示酶活性大小。3.1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定（1）原理：采用氮藍(lán)四唑（NBT）法（李合生, 2000）測(cè)定SOD超氧化物歧化酶。已知 SOD 活性單位以抑制NBT光化學(xué)還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD活性=2

16、（ACK-AE）×V/ACK×W×Vt(2.5)； SOD比活力=SOD活性/蛋白質(zhì)含量 (2.6)其中：ACK-照光對(duì)照管的吸光度； AE-樣品管的吸光度； V- 樣品液的總體積，mL； Vt-測(cè)定時(shí)樣品用量，mL； W-樣品鮮重，g。 SOD 活性單位 U/g FW，蛋白質(zhì)含量單位為 mg/g，SOD 比活力單位為U/mg蛋白。（2） 試劑： 0.05 mol/L磷酸緩沖液（PH 7.8） 130 mmol/L甲硫酸銨（Met）溶液：稱取1.9399 g Met用磷酸緩沖液定容至100 mL 750 mol/L 氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133g NBT用磷酸

17、緩沖液定容至100ml，避光保存。 100 mol/L EDTA-Na2溶液：稱取0.03721 g EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二鈉），用磷酸緩沖液定容至1000 mL 20 mol/L 核黃素溶液：稱取0.0753 g 核黃素用蒸餾水定容至1000 mL 避光保存。（3）儀器：高速臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000lx）（4）具體步驟： 酶液提?。?稱植物葉片0.5 g于研缽中分次加入0.05 mol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液5 mL以及少量（1 mL1%）的PVP，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，再用4 mL緩沖液清洗研缽中的殘?jiān)?。勻漿在高速冷凍離心機(jī)上4

18、19000 r/min離心10 min,收集的酶液用于活性測(cè)定。（提取酶液即為10 mL） 顯色反應(yīng)：取5 mL透明度好的指形管4支，2支為測(cè)定管，2支為對(duì)照管，按下表加入各溶液。混勻后，將1支對(duì)照管放置在暗處，其它各管于4000lx日光下反應(yīng)20 min。 SOD活性測(cè)定：反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩于其它試管，終止反應(yīng)，以不照光的對(duì)照管作為空白，分別在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度，計(jì)算其活性。3.1.7 過氧化氫酶（CAT）的測(cè)定（1） 試劑： 0.2M PBS 0.1 mol/L H2O2：（市售30%H2O2約為17.6 mol/l，取30% H2O2溶液5.68 mL，稀釋至1000

19、mL，用標(biāo)準(zhǔn)的0.1mol/lKMnO4溶液酸性條件下進(jìn)行標(biāo)定） 0.1 mol/L KMnO4溶液：KMnO4分析純3.1605 g，用新煮沸冷卻的蒸餾水配制成1000 mL（2） 酶液提?。?稱植物葉片0.5 g于研缽中分次加入0.05 mol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液5 mL以及少量（1 mL 1%）的PVP，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，再用4 mL緩沖液清洗研缽中的殘?jiān)?。勻漿在高速冷凍離心機(jī)上44000 r/min離心10 min,收集的酶液用于活性測(cè)定。（提取酶液即為10 mL）（3） 測(cè)量：取10 mL試管5支，其中4支樣品管，1支空白對(duì)照管按下表加入各試劑。表2 過氧

20、化氫酶測(cè)定時(shí)各試劑加入量試管號(hào)蒸餾水（mL）粗酶液（mL）PBS（mL）S01.00.21.5S11.00.21.5S21.00.21.5S31.00.21.5S41.00.21.53.1.8 總汞的測(cè)定用 Teflon罐消解樣品，F(xiàn)732-V智能型冷原子吸收測(cè)汞儀測(cè)定總汞，同樣的方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)和空白。每個(gè)樣品作三個(gè)平行樣，取平均值。具體步驟如下：植物樣品 60烘干過夜，稱量根莖葉的總量之后，研磨，過 100目篩，稱取 0.20 g植物樣品（記錄每份樣品質(zhì)量）于 15 mL Teflon罐中，加入 5mL 濃硝酸，置于烘箱中 85消解 4 小時(shí)，此時(shí)植物全部消解完全，消解液為澄清。靜止冷卻，過濾

21、并定容至 50 mL容量瓶。從容量瓶中吸取0.5 mL溶液進(jìn)樣，加入1 mL10%氯化亞錫，測(cè)定含量。（根、葉中汞含量分析）3.2 蛋白質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定3.2.1 超薄切片制作及電鏡觀察脅迫5天后，分別取對(duì)照與各濃度梯度處理的桐花幼苗的葉片，洗凈，將樣品放在冷的固定液中切成0.5 cm的長(zhǎng)度（1 mm的柱狀）。迅速地將樣品放在前固定液并冷藏于4的環(huán)境中。2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。用0.1 M PBS 漂洗3次，每次15分鐘，用1% OsO4 4避光固定23小時(shí)，漂洗后丙酮系列脫水。包埋后超薄切片機(jī)切片6080 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，JEM-2100透射電鏡（生

22、科院可預(yù)約）觀察、拍片。3.2.2可溶性蛋白含量測(cè)定 按照李合生等的方法（李合生，2000）用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色，在波長(zhǎng)為595 nm處進(jìn)行比色。用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。（1）試劑: 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:100 g/mL牛血清白蛋白:稱取牛血清白蛋白25 mg,加水溶解并定容至100 mL,吸取上述溶液40 mL,用蒸餾水稀釋至100 mL即可。 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，加入100 mL 85%（w/v）的磷酸，再用蒸餾水定容到1 L，貯于棕色瓶中，常溫下可保存一個(gè)月。（2）儀器：722分光光度計(jì)，研缽，燒杯，量瓶，

23、移液管，具塞刻度試管（3）具體步驟： 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6支具塞試管按表所列加入各試劑，搖勻。放置3 min，用1 cm光徑比色皿在595 nm波長(zhǎng)比色。以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3 可溶性蛋白含量測(cè)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作試劑加入量試管號(hào)123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液/mL00.200.400.600.801.00蒸餾水量/mL1.000.800.600.400.200考馬斯亮藍(lán)/mL555555蛋白質(zhì)含量/g020406080100 樣品測(cè)定：取酶提取液40 L，置于具塞試管中，加入pH7.8的磷酸緩沖溶液至總體積為1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，靜置3 mi

24、n。595 nm波長(zhǎng)比色，比色反應(yīng)在1 h內(nèi)完成？。 計(jì)算：根據(jù)樣品提取液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。P=（C×V）/（W×Vt）其中：C-查得的蛋白質(zhì)含量（由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得），g； V-提取液總體積，mL； Vt-測(cè)定時(shí)所吸取的體積，mL； W-樣品重，g； P -蛋白質(zhì)含量（鮮重），g/g。3.2.3 蛋白的層析分析（方法有待完善）桐花幼苗用HgCl2溶液培養(yǎng)5d 后,分別取根和葉片,用蒸餾水沖洗干凈,吸水紙吸干表面水分，稱重，然后用Tris HCl 10 mmol/ L（pH 8. 6） 緩沖液在研缽中磨成勻漿（材料與緩沖液的

25、比為12）。搜集勻漿在4 低溫下12 000 ×g離心45 min。上清液經(jīng)Sephadex G275 柱(1. 5 ×100) 分離。以Tris HCl 10 mmol/ L （pH 8.0，含NaCl 0.1 mol/ L）為平衡和洗脫液。上柱樣品為3ml ，流速為40 ml/ h ，按6. 67 ml/管分部收集洗脫液。每管洗脫液中Pb 含量用日立Z28000 原子吸收光譜儀測(cè)定。分子量鑒別用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清蛋白（67 kD）、卵清蛋白（44 kD）、胰蛋白酶（23. 5kD）、細(xì)胞色素C（12. 3 kD） 和胰島素（6 kD） (楊居榮等1993)。3.2.4

26、非蛋白巰基（non-protein thiol，NPT）含量的測(cè)定非蛋白巰基（non-protein thiol，NPT）采用DTNB 顯色法（Rama Devi S, Prasad M N V，1998）測(cè)定。稱取樣品鮮樣1.00 g，加入4 mL 預(yù)冷的5%（W/V）磺基水楊酸，冰浴研磨，冰浴30 min，然后離心（8 000×g，4 ）15 min。取上清液0.8 mL，依次加入3.05 mL 0.25 mol·L-1 的Tris-HCl （pH8.3） 和0.15 mL 10 mmol·L-1 的DTNB，室溫下放置20 min，然后用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)41

27、2 nm）測(cè)定樣品吸光度值。非蛋白巰基（non-protein thiol，NPT）是植物重金屬解毒機(jī)制中的主要物質(zhì)之一，它主要由富含巰基的物質(zhì)組成，包括植物螯合肽（PCs）、谷胱甘肽（GSH）、-谷氨酰半胱氨酸（-EC）、半胱氨酸（cysteine）等（安志裝等，2004）。巰基能結(jié)合Hg離子，減少細(xì)胞內(nèi)自由態(tài)Hg，達(dá)到解毒的目的。因此，桐花樹不同部位的NPT 含量可以反映桐花樹對(duì)Hg 的耐受能力。3.2.5 細(xì)胞可溶部分Hg的分子分布（方法有待完善）參考Guo 等的方法，分別稱取Hg 處理的鮮樣約8.5 g，加入17 mL 預(yù)冷的勻漿液（50 mmol/L Tris-HCl（pH8.6），

28、1 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF），用差速離心法分離出細(xì)胞可溶部分，冷凍干燥，復(fù)溶，過濾后，用葡聚糖凝膠G-75 柱（Sephadex G-75 Fine）進(jìn)行凝膠過濾，每管5 mL，收集40 個(gè)流分。將每個(gè)流分分裝，一部分用ICP-AES 測(cè)定Cd 濃度，另一部分用磺基水楊酸酸化沉淀蛋白，離心，取上清液，用DTNB 顯色法（Rama Devi S, Prasad M N V，1998）測(cè)定NPT 濃度。4. 經(jīng)費(fèi)預(yù)算本實(shí)驗(yàn)主要分為桐花樹基本生理指標(biāo)的測(cè)定和蛋白指標(biāo)的測(cè)定，基本生理指標(biāo)測(cè)定的費(fèi)用主要是試劑和藥品的購買，費(fèi)用不會(huì)過多；桐花樹蛋白指標(biāo)的測(cè)定和蛋白層析的費(fèi)用還有待進(jìn)一步確定。參考文獻(xiàn)1林鵬,傅勤. 中國(guó)紅樹林環(huán)境生態(tài)及經(jīng)濟(jì)利用M. 1995，北京：高等教育出版社.2林鵬. 中國(guó)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)M. 1997，北京：科學(xué)出版社.3解凱彬,施國(guó)新,杜