第七章植物基因工程1-4

1、第八章 植物基因工程基因工程：在基因的水平上改造生物的技術(shù)體系，是指在體外對生物DNA進(jìn)行剪切、加工，把不同親本的DNA分子重新組合，并把它引入細(xì)胞中表達(dá)出具有新的遺傳特性的生物這一過程。植物基因工程：又稱植物遺傳轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)基因，是將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)，并穩(wěn)定地整合、表達(dá)與遺傳的技術(shù)。目的是改變植物性狀，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)high yield、抗逆新品種/系；或者利用轉(zhuǎn)基因植物/細(xì)胞來生產(chǎn)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。植物轉(zhuǎn)基因研究的用途：1）理論研究：如基因功能分析；2）實踐應(yīng)用：如作物遺傳改良?；蚬こ痰幕緝?nèi)容 1）目的基因的分離；2）目的基因與載體連接；3）重組分子轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞并繁殖；4）陽性克

2、隆的篩選；5）從陽性克隆中提取已擴(kuò)增的目的基因；6）目的基因克隆到表達(dá)載體，導(dǎo)入寄主細(xì)胞并表達(dá)。植物基因工程的一般流程目的基因的分離表達(dá)載體的構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體的篩選、鑒定與植株再生轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測 轉(zhuǎn)基因植物的表型鑒定 轉(zhuǎn)基因植物的遺傳分析、田間試驗經(jīng)遺傳改良的生物, 統(tǒng)稱：genetically modified organism (GMO)；Genetically engineered organism (GEO)。轉(zhuǎn)基因植物 (transgenic plants), 又稱：genetically modified plant (GMP)； genetically modifie

3、d crop (GMC)。第一節(jié) 目的基因的分離目的基因：已經(jīng)或準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或 DNA 片段，稱為?？赡苁?1）全長基因：外顯子+內(nèi)含子+轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)+終止區(qū)；2）全長cDNA：UTR區(qū)+編碼區(qū)（ORF）；3）開放讀框/編碼區(qū)（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻譯成多肽的那部分序列。來自DNA分子中的外顯子。 4）一個完整的操縱子或基因簇；5）只含啟動子或終止子等元件的 DNA 片段。1. 分離目的基因的策略/方法：1) 基于已知/同源序列分子雜交/篩庫與PCR；cDNA文庫和基因組文庫（1）構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫；基因組文庫：將生物基因組DNA

4、切割成一定大小的片段，與合適的載體連接并導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，包含該生物所有的基因。 cDNA文庫 (cDNA library)：以某一組織、器官或處理材料中的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA 分子，插入載體形成重組分子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合，即為cDNA文庫，包含正在表達(dá)的基因。 （2）用已知或同源序列標(biāo)記探針、篩庫。經(jīng)典、較常用。篩庫菌落原位雜交 如果所要獲得的基因在其它植物上已經(jīng)分離 ,序列已知 ,則可以采取以下兩種方法分離研究植物上的相關(guān)基因:一是基因序列同源克隆法。根據(jù)發(fā)表的序列設(shè)計

5、引物 ,以基因組 DNA 或 mRNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。如果得到的只是基因部分序列 ,可以將其克隆至載體 ,作為探針篩選cDNA文庫和基因組(gDNA)文庫獲得全長基因或用 RACE得到全長基因。二是用作探針直接篩庫。若能得到其它植物已分離的相關(guān)基因 ,則可以直接用作探針篩選 cDNA 文庫和基因組(gDNA)文庫 ,獲得研究植物里的基因.（3）用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因gDNA-PCR;RT-PCRRACE-PCR；簡捷、常用2) 基于轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異DDRT-PCR：mRNA差異顯示技術(shù)，DDRT-PCR: 根據(jù)真核生物3 端poly(A)尾的特點設(shè)計錨定引物, 這

6、些引物組合擴(kuò)增后約能得到大致包括某一發(fā)育階段的全部基因 ,擴(kuò)增后利用測序膠分離 ,放射自顯影或銀染獲得結(jié)果 ,并對差異片段回收、 克隆、 測序以確定其是否為目的基因。SSH：抑制性差減雜交，此技術(shù)是以抑制 PCR和雜交二級動力學(xué)為基礎(chǔ)的DNA扣除雜交方法。含有目的基因的樣品稱為檢測方,不含有目的基因的樣品稱為驅(qū)動方。3) 基于人工突變體T-DNA標(biāo)簽法與 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法 ；適用于模式植物T-DNA: 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中一段可轉(zhuǎn)移DNA，插入基因引起突變。機(jī)制：T-DNA 或轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到基因組的某一位點 ,引起該位點基因功能改變 ,這個位點就被標(biāo)記 ,再利用 T-DNA 或轉(zhuǎn)座子序列探針對突

7、變基因組文庫進(jìn)行篩選或設(shè)計引物擴(kuò)增 ,就可以分離出標(biāo)記位點的基因。4) 基于分子標(biāo)記連鎖圖譜圖位/定位克??；要求精細(xì)物理圖譜等圖位克?。簭囊环N基因的染色體定位出發(fā)，逐步縮小范圍，最后克隆該基因，又叫定位克隆。機(jī)制：根據(jù)功能基因在基因組中都有相對穩(wěn)定的基因座位 ,利用分子標(biāo)記對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位 ,并用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選 DNA 文庫 (包括 Y AC、 BAC、TAC、 PAC或 Cosmid庫) ,從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜 ,再利用此物理圖譜通過染色體步查(chromos ome walking )逐步逼近目的基因或通過染色體著陸(chromos ome landing

8、)的方法最終找到含有目的基因的克隆 ,再經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化證實目的基因的功能.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)（1）構(gòu)建遺傳作圖群體用于作圖群體的類型可有多種。（2）篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。（3）局部區(qū)域的精細(xì)定位、作圖（4）構(gòu)建高質(zhì)量的基因組文庫（5）染色體步行、登陸。（6） 鑒定目標(biāo)基因 圖位克隆的基本流程：（1）構(gòu)建遺傳圖譜：目的基因初步定位分子標(biāo)記；（2）構(gòu)建物理圖譜：局部區(qū)域的精細(xì)作圖，目的基因精細(xì)定位 (kb/cM)；（3）構(gòu)建基因組文庫：BAC、YAC、Cosmid等；（4）染色體步行或登陸：獲得候選克隆 探針；（5）篩選基因文庫：獲得目的克隆；（6）鑒定目的基因。5) 其他方法人工合成，適用

9、于小基因、突變或修飾；基因表達(dá)譜(Macroarray/Microarray)分析:基因芯片/微矩陣第二節(jié) 基因克隆的主要工具酶1. 限制性核酸內(nèi)切酶限制作用:指宿主細(xì)胞利用限制酶降解外源DNA，保護(hù)其遺傳穩(wěn)定的現(xiàn)象。修飾作用: 指宿主細(xì)胞通過甲基化酶使自身DNA進(jìn)行甲基化修飾, 達(dá)到識別自身和外來DNA 、使自身DNA免遭限制酶降解的現(xiàn)象兩種末端粘性末端：酶切位點在兩條DNA單鏈上反向互補(bǔ)，產(chǎn)生的兩個末端堿基互補(bǔ)配對，易連接。 平齊末端： 酶切位點在兩條DNA單鏈上相同，形成平齊末端，較難連接。限制酶：一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并由此切割雙鏈DNA分子的核酸水解酶，水解

10、DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端為P，3端為OH。 2. DNA連接酶DNA連接酶：催化雙鏈DNA切口（nick, 而非裂口/缺口 gap) 處的5-P和3-OH生成磷酸二酯鍵，需能量。T4 DNA連接酶: 需ATP，制備容易，連接具有粘性末端或平末端的DNA分子，應(yīng)用廣泛。 3. DNA聚合酶1) E.coli DNApol I：制備探針、缺口填充等。2) Klenow片段(E.coli DNApol I 經(jīng)蛋白酶處理, 獲得N端三分之二的大肽段) : 補(bǔ)平粘端、DNA片段末端標(biāo)記、cDNA第二鏈的合成等。 3) 逆轉(zhuǎn)錄酶：RNA依賴的DNA聚合酶，合成cDNA鏈。AMV和MLV

11、。4) 耐熱 DNA 聚合酶：Taq DNA 酶、 Pfu DNA 聚合酶等。第三節(jié) 受體細(xì)胞/系統(tǒng)定義：外源DNA導(dǎo)入、擴(kuò)增、表達(dá)的細(xì)胞。對受體菌的要求: ）易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)：感受態(tài)；）限制-修飾系統(tǒng)缺陷型；）重組系統(tǒng)缺陷型：recA、 recB等失活； ）有明顯的選擇性差異，便于重組子篩選；）載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻；）感染寄生缺陷型。常用Ecoli K12 派生株系。第四節(jié) 植物轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體1. 載體（vector）: 將外源 DNA 攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具，本質(zhì)是DNA。載體的基本構(gòu)件：1）自主復(fù)制元件，或能整合在宿主基因組進(jìn)行復(fù)制；2）多克隆位點（MCS）: 插入外源DNA；3）選擇標(biāo)記

12、：如抗性基因，篩選重組子；4）基因表達(dá)元件：啟動子、終止子?；蚬こ讨兴玫妮d體按功能分：1）克隆載體：外源基因的保持與擴(kuò)增；2）表達(dá)載體：外源基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄與翻譯）。2. 植物轉(zhuǎn)化載體的種類與特點2.1 植物病毒載體類型：單鏈RNA病毒、單鏈DNA病毒、雙鏈DNA病毒。構(gòu)建策略：通過置換或插入等方法，去除基因組中的致病基因或不重要區(qū)域，插入外源基因。由CaMV (花椰菜花葉病毒)、 TGMV(番茄金色花葉病毒）、BMV (雀麥花葉病毒）、CPMV(豇豆花葉病毒）構(gòu)建的載體已得到轉(zhuǎn)化植株或細(xì)胞。病毒載體的優(yōu)點：1）能將外源基因直接導(dǎo)入完整植株，并系統(tǒng)地分布到整株，免去組培再生操作；2）不受單

13、、雙子葉寄主的限制；3）外源基因隨病毒基因組快速、大量復(fù)制，易得到基因表達(dá)產(chǎn)物；4）一般不整合到植物基因組，不影響植物基因表達(dá)。病毒載體的缺點：1）外源基因不能整合到植物基因組，瞬時表達(dá)，故不能穩(wěn)定遺傳；2）存在致病的可能性；3）由于病毒的高變異性，使外源基因exogenous易于丟失。 病毒載體的應(yīng)用：1) 基因功能研究：主要領(lǐng)域，瞬時表達(dá)。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silence，VIGS）技術(shù)：近幾年發(fā)展，用攜帶目標(biāo)基因的病毒載體侵染植物，誘導(dǎo)相關(guān)基因沉默，根據(jù)表型推斷目標(biāo)基因的功能。2) 生產(chǎn)疫苗等醫(yī)用蛋白。2.2 農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌：土壤桿菌，G-，

14、主要侵染雙子葉，致瘤。根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens )：誘發(fā)產(chǎn)生冠癭瘤， 致瘤性來自Ti質(zhì)粒。發(fā)根農(nóng)桿菌 (A.rhizogenes): 誘發(fā)產(chǎn)生毛根癥，病癥來自Ri質(zhì)粒經(jīng)改造后的Ti 和 Ri質(zhì)粒是植物轉(zhuǎn)化的理想載體。2.2.1 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒：1974年分離, 160 - 240 kb, 大型環(huán)狀雙鏈DNA分子。其與植物DNA結(jié)合的部分（稱為 TDNA） T-DNA： 1977年證明，是Ti質(zhì)粒上一段可轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并整合在染色體上的DNA， 載有誘導(dǎo)冠癭瘤的基因。Ti質(zhì)粒的類型根據(jù)所合成的冠癭堿種類，分4類：1）章魚堿型(octopine

15、type)；2）胭脂堿型(nopaline type)；3）農(nóng)桿堿型；4）農(nóng)桿菌素堿型/琥珀堿型。冠癭堿：氨基酸類似物，農(nóng)桿菌的碳源和氮源。Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒的分區(qū)：1) T-DNA區(qū)T-DNA：轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并整合在植物核基因組的一段DNA，通常23kb (12 - 24 kb )，載有致瘤基因和冠癭堿合成酶基因，以及左、右邊界重復(fù)序列LB和RB。功能：轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，致瘤基因產(chǎn)物可使侵染部位產(chǎn)生冠癭瘤。2) Vir 區(qū)Vir 區(qū)：毒性區(qū)，3540kb, 含7個基因/操縱子。功能：接受植物創(chuàng)傷信號分子，啟動Vir基因表達(dá)，協(xié)同其他因子完成T-DNA解旋、單鏈切割、加工及轉(zhuǎn)移等過程

16、，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)毒性。3) Ori區(qū)復(fù)制起始區(qū)，調(diào)控質(zhì)粒自我復(fù)制。4) Con區(qū)接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)，編碼與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra）。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。5)冠癭堿代謝區(qū)分解利用冠癭堿作為自己的碳源和氮源。2.2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒Ri質(zhì)粒：200800kb，與Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相似。根據(jù)冠癭堿的種類, 可將Ri質(zhì)粒分為三類 甘露堿型, 合成甘露堿、甘露堿酸、農(nóng)桿堿酸和農(nóng)桿堿素, 黃瓜堿型, 合成黃瓜堿 農(nóng)桿堿型, 合成農(nóng)桿堿、農(nóng)桿堿酸、甘露堿、甘露堿酸和農(nóng)桿堿素。 Ri質(zhì)粒的優(yōu)點：1）誘導(dǎo)的不定根可分化成完整再生植株，載體可不解除武裝（onc+載體）；2）每條發(fā)狀根是一個單細(xì)

17、胞克隆，可避免嵌合體；3）發(fā)狀根適于離體培養(yǎng)，而且具有原植株的次生代謝物合成能力，可用于次生代謝物生產(chǎn)。3. 野生型Ti 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與致瘤性 3.1 T-DNA 的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA ：含2類基因：1） 致瘤基因: tms和tmr，即生長素與細(xì)胞分裂素合成基因，可致瘤；2） 冠癭堿合成酶基因: tmt，冠癭堿是農(nóng)桿菌生長的碳源和氮源。有2個保守序列：LB和RB：即左邊界和右邊界，25bp正向重復(fù)序列，缺失RB則不能轉(zhuǎn)移。 章魚堿型與胭脂堿型T-DNA 的差別胭脂堿型：T-DNA是連續(xù)的片段，編碼13個基因；章魚堿型：T-DNA由2個分離的片段組成，左區(qū)（TL-DNA）14kb, 有8個基因，

18、右區(qū)（TR-DNA）7kb, 有5個基因；LB右邊約17bp處有一個24bp的超驅(qū)動序列OD ，促進(jìn)T鏈形成，起轉(zhuǎn)移增強(qiáng)子作用。 3.2 Vir區(qū)基因的結(jié)構(gòu)與功能章魚堿型：含有virA、virB、virC、virD、virE、virF、virG、virH等操縱子/基因；胭脂堿型：含有Tzs、virA、virB、virC、virD、virE、virG等操縱子/基因；除virF 外，其他vir 基因的突變均能消除或減弱農(nóng)桿菌的致病性。3.3 T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合機(jī)理 3.3.1 T-DNA的轉(zhuǎn)移植物創(chuàng)傷釋放乙酰丁香酮農(nóng)桿菌附著乙酰丁香酮與VirA結(jié)合并激活VirA 激活VirG誘導(dǎo)Vir基因表達(dá)

19、 VirD先后在同一條T-DNA單鏈的RB和LB特定位點切割、釋放T-DNA單鏈/T鏈VirD2、VirE2等與T鏈形成復(fù)合物VirB形成跨膜通道 RB及VirD2、VirE2所含NLS(nulear localization signals)引導(dǎo)T鏈以類接合方式進(jìn)入植物細(xì)胞。VirD區(qū)：有VirD14四個ORF。VirD1 編碼DNA松弛酶；VirD2 有限性核酸內(nèi)切酶活性（N端）以及NLS信號 nulear localization signals （2個），可在T-DNA的LB、RB序列進(jìn)行特異性切割，并與釋放的T-DNA單鏈5端結(jié)合、引導(dǎo)其向核轉(zhuǎn)運(yùn)；VirD3保守性很小，功能不清楚；V

20、irD4蛋白N端有信號肽，引導(dǎo)其到達(dá)內(nèi)膜，其C端可能與周質(zhì)腔中的因子結(jié)合。3.3.2 T-DNA的整合T鏈以非正常重組方式隨機(jī)插入染色體某一位點，并在植物重組修復(fù)系統(tǒng)作用下形成雙鏈，整合到基因組。整合不依賴序列相似性，但插入位點常有下列特征：1）優(yōu)先插入到轉(zhuǎn)錄活躍的基因位點；2）T-DNA與植物DNA連接處富含A/T；3）插入位點與T-DNA邊界序列有一定同源性；4）插入位點常有一些額外序列，稱為填充DNA； 5）插入位點常有缺失、到位和重復(fù)。 一些植物蛋白參與整合，但機(jī)理不清楚。T-DNA整合的模型：Mayerhofer等。1）雙鏈斷裂修復(fù)模型Double-Stranded Breaking

21、 Repair (DSBR model): 植物靶DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，解旋的靶DNA與雙鏈T-DNA退火；單鏈部分被降解去除；隨后進(jìn)行修復(fù)連接，并由此導(dǎo)致DNA 的整合和缺失；靶DNA和T-DNA缺失程度由二者互補(bǔ)順序的位置所決定。2）單鏈缺口修復(fù)模型Single-stranded Gap Repair (SSGR model):在靶DNA上形成1個缺刻 部分解旋或外切酶消化形成缺口 T-鏈靠近缺口，末端經(jīng)互補(bǔ)序列退火，形成異源雙鏈 T-鏈的單鏈部分被降解去除 T-鏈末端與靶DNA連接 靶DNA的上鏈產(chǎn)生缺口 以T鏈為模板，合成第二條T-NDA鏈。3.3.3 T-DNA的致瘤機(jī)理 T-DNA整

22、合于植物染色體DNA后，其上的致瘤/激素基因表達(dá)，細(xì)胞不規(guī)則分裂形成腫瘤。離體培養(yǎng)下，T-DNA導(dǎo)入植物后抑制細(xì)胞分化和植株再生。小結(jié)：1）農(nóng)桿菌被植物創(chuàng)傷信號分子吸引并附著于植物細(xì)胞；2） VirA受體與信號分子結(jié)合并被激活；3）其他Vir基因被誘導(dǎo)表達(dá)；4）T-鏈復(fù)合體的形成與導(dǎo)入；5）T-DNA整合；6）T-DNA上的致瘤基因表達(dá)，形成腫瘤。4. Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建4.1 構(gòu)建策略除去T-DNA上的致瘤基因，使植株再生； 除去T-DNA上冠癭堿合成基因，不消耗底物氨基酸，利于植物細(xì)胞生長；除去其它非必需序列，縮短載體長度；加入多克隆位點MCS，便于外源基因的克??；加入E.coli ori

23、及選擇標(biāo)記，使在E.coli中復(fù)制，便于克隆操作；加入啟動子與終止子, 使目的基因表達(dá)；加入植物選擇標(biāo)記，便于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選。4.2 常用的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)4.2.1 共整合載體系統(tǒng)由卸甲載體與中間載體構(gòu)建物而成的一元載體系統(tǒng)。卸甲載體（onc-）：去除致瘤基因，刪除部位被質(zhì)粒載體pBR322取代的Ti質(zhì)粒載體被稱為 ，可以轉(zhuǎn)化植物。任何克隆在pBR322中的外源DNA片段，都可通過與卸甲載體中的pBR322質(zhì)粒DNA進(jìn)行同源重組而被整合到卸甲載體（受體）上。常用的卸甲載體：pGV3850、pGV2250、pTiB6S3-SE。共整合載體：當(dāng)E.coli與農(nóng)桿菌接合轉(zhuǎn)移時，由中間載體和卸甲載體

24、經(jīng)pBR322序列同源重組，在農(nóng)桿菌中產(chǎn)生的一種大型的復(fù)合載體，稱為。目的基因定位在Ti質(zhì)粒的T-DNA邊界序列之間，用該共整合載體轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可再生完整植株。4.2.2 雙元載體系統(tǒng) 包含2個獨立的質(zhì)粒：1）穿梭質(zhì)粒：能在E.coli 和 A.t.(農(nóng)桿菌）中生存/穿梭，克隆載體，T-DNA區(qū)插入目的基因、MCS和植物選擇標(biāo)記基因。2）Ti 卸甲載體：含 vir基因和復(fù)制起始區(qū)ori A，缺失T-DNA，輔助質(zhì)粒，促使T-DNA 轉(zhuǎn)移。特點：Vir 基因與T-DNA分開存在于2種質(zhì)粒，當(dāng)E.coli 與 A.t.發(fā)生接合轉(zhuǎn)移后，2種質(zhì)粒可在A.t.細(xì)胞內(nèi)獨立共存；當(dāng)A.t.感染植物時，Ti 卸甲載體產(chǎn)生的 Vir蛋白與穿梭質(zhì)粒的RB互作，使帶有目的基因的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。4.3 外源基因表達(dá)調(diào)控序列 外源基因：任何非受體細(xì)胞本身的基因，包括目的基因、選擇標(biāo)記基因和報告基因。常用表達(dá)調(diào)控序列 ：CaMV 3