DNA細胞周期檢測

1、Key lab of Medical College of Su Zhou University基本原理概述 正常人靜止體細胞有46條染色體，相當于7.10-12 pg DNA/細胞核，我們稱之為二倍體細胞，而正常增殖細胞則存在不同的DNA含量。在細胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化：在G1期，細胞開始RNA和蛋白質的合成，但DNA含量仍保持二倍體；Key lab of Medical College of Su Zhou University 進入S期后，DNA開始合成，這時細胞核內DNA的含量介于G1和G2期之間；當DNA復制結束成為4倍

2、體時，細胞進入G2期，G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質，直到進入M期，因此，單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期；一旦有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個子細胞，這兩個子細胞或者進入下一個細胞周期，或者進入靜止期(G0期)，而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因此，整個復制周期可以描述為G0/G1，S，G2/M期。Key lab of Medical College of Su Zhou University 通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解細胞的增殖能力，在腫瘤病理學研究中，通常以S期細胞比率作為判斷

3、腫瘤增殖狀態(tài)的指標。正常細胞具有較恒定的DNA含量，而細胞癌變過程中結構和/或染色體的異常是很常見的。這種變化在流式分析中以DNA倍體指數(shù)的形式表現(xiàn)出來，這一指數(shù)對于腫瘤的早期診斷，交界瘤、間葉組織腫瘤的良惡性判斷提供了重要的輔助指標。Key lab of Medical College of Su Zhou University流式DNA周期示意圖G0/G1靜止期及合成前期S合成期G2/M合成后期及分裂期Key lab of Medical College of Su Zhou University樣本制備 來源于血液、骨髓、體液、灌洗液、外科手術活檢、細針穿刺物等的細胞都可用來做DNA分析

4、。新鮮的、冰凍或固定保存的、或常規(guī)固定/包埋用于組織檢查的樣本均可。通常最好的結果來自新鮮或冰凍的標本。用組織切片的好處是可以通過觀察常規(guī)染色來選擇感興趣的區(qū)域，缺點是不能再用抗體染色來鑒別腫瘤細胞和正?；|細胞。Key lab of Medical College of Su Zhou University實體標本的單細胞制備 機械法：用剪刀、刀片剪切組織或金屬網(wǎng)研磨獲取完整的細胞。但該法獲取的細胞數(shù)量少。 化學藥品處理法：利用EDTA或Sodium citrate結合Ca2+或Mg2+等陽離子，破壞細胞間的連接或用Triton X-100、NP-40破壞細胞膜。該法只能取得細胞核，且易出現(xiàn)

5、核凝集。 酶法：利用酶將細胞間的連接物水解，使細胞從組織中分離出。一般常用的為胃蛋白酶及胰蛋白酶。該法也只能取得細胞核。Key lab of Medical College of Su Zhou University細胞濃度及質量要求 單細胞和核的最終濃度應約106/ ml。濃度太低，上機時樣本的流速不得不提高，這樣就會影響檢測的CV。濃度太高，則可能導致染料的相對不足，最終使染色不飽和，同樣影響CV和檢測結果。 制備完成后的標本應用光學顯微鏡檢查其質量：細胞是否聚集或過多的碎片；大多數(shù)核有腫瘤樣的外觀(比如說，不是粒細胞)等。保證足夠的腫瘤細胞含量；檢測S%時建議的最小可接受比例是20%。K

6、ey lab of Medical College of Su Zhou University固定 常用70%的冰酒精固定單細胞懸液。應保證樣本完全浸沒在固定劑中置40C冰箱固定4小時上。 對于甲醛固定的組織切片，應注意甲醛會影響PI與核酸的結合。若同時使用抗體鑒別腫瘤細胞，應選擇對抗原無損的固定劑。對許多細胞 表面抗原來說，固定只能在抗體標記之后進行。Key lab of Medical College of Su Zhou University染色 染料的選擇取決于流式激光的配置。488nm的激光下應用PI(碘化丙啶)，由于PI也與雙鏈RNA結合，所以分析前樣本應用Rnase處理。重要的是

7、染料要足夠，以保證飽和結合。PI的推薦濃度是至少20ug/106 個細胞。其最佳濃度為50ug/106 個細胞。在室溫200C下避光孵育30分鐘，3小時內上機分析。Key lab of Medical College of Su Zhou University影響熒光染色的因素1.溫度：溫度高于200C時，即出現(xiàn)溫度淬滅。2.PH：PI在7.27.6，保持熒光染料分子與溶劑間的電離平衡。3.熒光染料濃度：染料太少，結合不完全。染料過多，又會出現(xiàn)濃度淬滅現(xiàn)象。4.固定劑：醛類固定劑會干擾插入性染料與核酸分子的結合，造成熒光發(fā)射強度減弱。5.雜質：溴化物、碘化物、硝基苯、鐵、銀等，對熒光有淬滅作用

8、。Key lab of Medical College of Su Zhou UniversityDNA的參考標準 樣本的倍體是根據(jù)二倍體細胞峰的標準來計算的。臨床標本中常常有一些正常的二倍體核存在，可用來作為標準。但問題是如何判斷哪個峰是正常二倍體細胞。事先加入標準參照細胞(如鱉或雞紅細胞)會有助于判斷。特殊細胞類型的特異性抗體標記也有助于檢出腫瘤群體。標準參照細胞應盡可能早加入標本，與樣本一起制備。Key lab of Medical College of Su Zhou UniversityDNA檢測 (1)DNA檢測采用線性放大。應檢查放大器的線性度(如用標準熒光微球、多倍體的肝細胞、

9、有聚集體的固定的淋巴細胞、雞和鮭魚紅細胞等)。 (2)應每日通過檢測標準微球或固定、染色的淋巴細胞的CV來檢查儀器調校情況，此CV應1.15為超二倍體；DI0.85為亞二倍體。） 但對于四倍體和G2/M期的判斷，一般用G2/M占G0/G1的20%以上即算四倍體。Key lab of Medical College of Su Zhou University漿膜腔脫落細胞良惡性判斷標準1.出現(xiàn)DNA的非整倍體峰為惡性腫瘤細胞。2.無明顯的非整倍體峰，但有一突出的四倍體峰和大于15%的S期細胞，并伴有G0/G1期CV值大于9%為惡性腫瘤細胞。3.無明顯的非整倍體峰，但 G0/G1期CV值增大，并伴

10、有大于10%15%的S期和一個突出的四倍體峰，診斷為可疑癌。Key lab of Medical College of Su Zhou University結果報告 報告中至少應包含以下信息： (1)DNA倍體，包括所有群體的DI； (2)主要G1峰的CV； (3)S期比例； (4)必要的簡單評價：如細胞數(shù)的不足、碎片較多、CV太高等。Key lab of Medical College of Su Zhou University 通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解細胞的增殖能力，在腫瘤病理學研究中，通常

11、以S期細胞比率作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標。正常細胞具有較恒定的DNA含量，而細胞癌變過程中結構和/或染色體的異常是很常見的。這種變化在流式分析中以DNA倍體指數(shù)的形式表現(xiàn)出來，這一指數(shù)對于腫瘤的早期診斷，交界瘤、間葉組織腫瘤的良惡性判斷提供了重要的輔助指標。Key lab of Medical College of Su Zhou University (4)閾值應設在DNA熒光參數(shù)上FL3 Peak 30-40。 (5)所有的信號都應被收集，包括從二倍體G1峰道數(shù)值1/10處以上的碎片。 (6)收集的細胞總數(shù)應在DNA直方圖中足夠提供10000個核(除外碎片)。DNA直方圖越復雜，需要收集的細胞數(shù)量越多。若需報告S期數(shù)值，則S期區(qū)域至少應有100個細胞。 (7)為獲得最佳CV，流速應保持在低速(通常100-300個粒子/秒)。Key lab of Medical Co