化妝品用化學(xué)原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法

1、化妝品用化學(xué)原料體外3t3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法 化妝品用化學(xué)原料 體外 3t3 中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法 一、范圍 本方法規(guī)定了化妝品用化學(xué)原料體外3t3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)材料與試劑、試驗(yàn)步驟、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。 本方法推薦適用于評(píng)價(jià)化妝品用化學(xué)原料的潛在光毒性。 二、規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過本方法的引用而成為本方法的條款。注明日期的引用文件，其后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本方法，但是，鼓勵(lì)使用單位對(duì)修訂部分的引用進(jìn)行研究，并提出意見。研究是否可使用這些文件的最新版本。未注明日期的引用文件，其最新版本適用于

2、本方法。 經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（oecd）guidelines for the testing of chemicals: 3t3 nru phototoxicity test. no. 432 三、術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本方法。 （一）光毒性（phototoxicity） 皮膚一次接觸化學(xué)物質(zhì)后，繼而暴露于長(zhǎng)波紫外線照射下所引發(fā)的一種皮膚毒性反應(yīng)。 （二）細(xì)胞活性（cell viability） 測(cè)量某一細(xì)胞群總活性的參數(shù)（如細(xì)胞溶酶體攝取活性染料中性紅），其數(shù)值取決于測(cè)定的終點(diǎn)和試驗(yàn)所用的設(shè)計(jì)方案，并與細(xì)胞總數(shù)和/或細(xì)胞活力相關(guān)。 （三）相對(duì)細(xì)胞活性（relative cell v

3、iability） 通過與溶劑（陰性）對(duì)照組的相關(guān)性來表達(dá)的細(xì)胞活性，對(duì)照組除了未經(jīng)受試化學(xué)物質(zhì)處理外，整個(gè)試驗(yàn)過程與試驗(yàn)組一樣（或+irr或-irr）。 （四）光刺激因子（photo irritation factor; pif） 受試物分別在無光照(-irr)和有光照(+irr，無細(xì)胞毒性的紫外光/可見光（uv/vis）照射)條件下獲得兩組平行有效的細(xì)胞毒性濃度(ic 50 )，通過比較ic 50 的值得到的因子。 （五）半數(shù)抑制濃度（ic50） 使細(xì)胞活性下降50%的受試化學(xué)物質(zhì)的濃度。 （六）平均光效應(yīng)（mean photo effect; mpe） 受試物分別在無光照(-irr)和有

4、光照(+irr，無細(xì)胞毒性的uv/vis照射)條件下獲得兩組濃度反應(yīng)曲線，通過數(shù)學(xué)分析導(dǎo)出的數(shù)值。 （七）預(yù)測(cè)模型（prediction model） 將毒性試驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換為預(yù)測(cè)毒性潛力的算法。在本方法中，pif和mpe可用于把體外3t3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的結(jié)果轉(zhuǎn)換為對(duì)光毒性潛力的預(yù)測(cè)。 四、試驗(yàn)原理 光毒性是指應(yīng)用于機(jī)體的物質(zhì)經(jīng)暴露于光線后誘發(fā)或增強(qiáng)（在低劑量水平時(shí)明顯）的毒性反應(yīng)，或全身應(yīng)用一種物質(zhì)后由皮膚光照引起的反應(yīng)。中性紅是一種弱的陽離子染料，極易以非離子擴(kuò)散的方式穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞溶酶體內(nèi)聚集。某些化學(xué)物質(zhì)和外界條件作用可引起細(xì)胞表面或溶酶體膜敏感性的改變導(dǎo)致溶酶體脆性增高等不可逆

5、的細(xì)胞毒性變化，從而導(dǎo) 致細(xì)胞吸收中性紅的能力下降。 本試驗(yàn)方法通過測(cè)定3t3成纖維細(xì)胞經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和紫外線照射聯(lián)合作用后細(xì)胞吸收中性紅的能力或細(xì)胞毒性的變化來判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光毒性。 五、試驗(yàn)材料與試劑 （一）光源類型 選擇合適的光源必須符合的標(biāo)準(zhǔn)包括：光源發(fā)射的光波長(zhǎng)能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個(gè)合理的暴露時(shí)間內(nèi)能達(dá)到的劑量）能滿足已知光毒性化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)。此外所有的波長(zhǎng)和劑量不能有損于試驗(yàn)系統(tǒng)，如（紅外區(qū)域）熱量散發(fā)或類似 uvb 波長(zhǎng)的高細(xì)胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放 uva 和可見光波長(zhǎng)。 由于所有的太陽光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的 uvb，應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪^

6、濾使 uvb0.1j/cm 2 。透過 96 孔組織培養(yǎng)板蓋的光強(qiáng)度建議為1.7mw/cm 2 光強(qiáng)度（即 5j/cm 2 ）劑量。 （二）細(xì)胞株 選用永生化小鼠成纖維細(xì)胞系balb/c 3t3成纖維細(xì)胞。要求細(xì)胞來源必須是具有公信力的機(jī)構(gòu)且能確保細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定。 由于細(xì)胞對(duì)uva的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高，建議用于試驗(yàn)的balb/c 3t3成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)最好少于100次。 測(cè)試單位若自行培養(yǎng)細(xì)胞株，則須定期檢測(cè)細(xì)胞株對(duì)uv光的敏感性，并確保無支原體污染。 （三）培養(yǎng)基 采用dmem培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/l）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100

7、iu和100g/ml）， 在36.537.5, 5%7.5%co 2 條件下培養(yǎng)。 （四）溶劑的選擇 在測(cè)定前，應(yīng)首先評(píng)價(jià)受試物的溶解度，以選擇最佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞活性。 能溶于水且濃度達(dá)1000g/ml的受試物可溶于預(yù)先加溫（37）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（ebss或pbs）。水中溶解度有限的受試物（1000g/ml）可用二甲基亞砜（dmso）或乙醇（etoh）等溶劑溶解。使用dmso或etoh作為溶劑時(shí)，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對(duì)照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。 （五）受試物的配制 受試物必須在使用前新鮮配制。建議所有的化學(xué)物質(zhì)操作和

8、細(xì)胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進(jìn)行。 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照（推薦使用氯丙嗪）。加樣示意圖見附錄b。 （六）受試物劑量的設(shè)置 需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子（如 10 3.16）稀釋成8個(gè)濃度，相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從最大細(xì)胞毒性至幾乎無細(xì)胞毒性濃度（細(xì)胞存活率在20%100%的范圍）。 如果預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在濃度等于 1000g/ml 時(shí)仍未出現(xiàn)細(xì)胞毒性，則建議最高濃度為 1000g/ml；若出現(xiàn)細(xì)胞毒性的濃度低于 1000g/ml時(shí)，有細(xì)胞毒性的濃度少于三種，則需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)或使用更小的稀釋

9、因子，直至出現(xiàn)有細(xì)胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度，最高濃度不能達(dá)到 1000g/ml，則以最大溶解度時(shí)的濃度作為最高濃度， 避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。 如果在無光照條件下(-irr)受試物在最高濃度時(shí)仍然不具有細(xì)胞毒性，而在有光照條件下(+irr)出現(xiàn)強(qiáng)烈細(xì)胞毒性，則在-irr試驗(yàn)和+irr試驗(yàn)中可采用不同的試驗(yàn)濃度。 （七）中性紅（neutral red，nr） 化 學(xué) 名 為 3- 氨 基 一 7 一 二 甲 氨 基 一 2 一 甲 基 吩 嗪 鹽 酸 鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride

10、) ， cas 編號(hào):553-24-2；或國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號(hào)：100460。 （八）中性紅溶液 1中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100ml蒸餾水（室溫條件下可保存2個(gè)月） 2中性紅使用液。在79ml dmem培養(yǎng)液中加入1ml中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50g/ml。 （九）中性紅解吸附溶液 將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，儲(chǔ)存不超過1小時(shí)）。 六、試驗(yàn)步驟 （一）加100l培養(yǎng)基于96孔組織培養(yǎng)板的外圍孔（空白對(duì)照），在其余孔中加入100l密度為110 5 個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液（即110 4 細(xì)胞/孔）。每次試驗(yàn)制備兩個(gè)板，包括相同的受試物濃

11、度系列、溶劑對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照，一個(gè)板用于確定細(xì)胞毒性（-irr），另一個(gè)板用于確定光毒性（+irr）。 （二）培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)（5%7.5%co 2 ，37）直至它們形成單層半飽和細(xì)胞。該培養(yǎng)過程允許細(xì)胞恢復(fù)和粘連。 （三）去除培養(yǎng)液，用150l ebss或pbs輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。加入100l含適當(dāng)濃度受試物或溶劑的緩沖液到孔中。培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)（5%7.5%co 2 ，37）。 （四）在室溫下將其中一個(gè)板進(jìn)行光照（+irr）暴露，以1.7mw/cm 2光強(qiáng)度透過96孔板蓋照射細(xì)胞50分鐘；同時(shí)將另一個(gè)平板無光照（-irr）置于暗盒內(nèi)50分鐘。 （五）去除受試溶液，用150l eb

12、ss或pbs仔細(xì)沖洗細(xì)胞兩次。加入100l培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜（1822小時(shí)，5%7.5%co 2 ，37）。 （六）在相差顯微鏡下檢查細(xì)胞，記錄受試物細(xì)胞毒性所致細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，用于排除試驗(yàn)誤差。 （七）中性紅吸收（nru）測(cè)量。細(xì)胞吸收中性紅進(jìn)入溶酶體和活細(xì)胞體內(nèi)空泡，可用作細(xì)胞數(shù)量和活性的定量指標(biāo)。 1用150l預(yù)溫的ebss或pbs沖洗細(xì)胞一次或兩次。輕柔拍打平板，去除沖洗溶液。加入100l含50g/ml中性紅的培養(yǎng)液，在5%7.5%co 2 ，37和濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)。 2去除中性紅培養(yǎng)液，用150l ebss或pbs沖洗細(xì)胞一次或兩次。 3輕輕倒出并吸干全部ebss或pb

13、s。 4準(zhǔn)確加入150l中性紅解吸附溶液。 5在微量滴定平板振蕩器上震蕩96孔板10分鐘，直至中性紅從細(xì)胞內(nèi)被提取出來，并形成均勻溶液。 6用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定中性紅提取物溶液在540nm波長(zhǎng)處的光密度。用空白孔作為參考對(duì)照。 七、結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) （一）確定以光刺激因子（pif值）為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型 1通過分析在有光照（+irr）和無光照（-irr）兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線，確定能抑制50%細(xì)胞活性的受試物濃度（ic 50 ），按下列公式計(jì)算光刺激因子（pif）。 pif ic 50 （-irr） ic 50 （+irr） 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：pif2：預(yù)測(cè)"無光毒性'；p

14、if5：預(yù)測(cè)"有光毒性'。pif介于25之間，需進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)；如果pif仍介于25之間，預(yù)測(cè)"有潛在光毒性'。 2如果受試物在有光照（+irr）時(shí)有細(xì)胞毒性，無光照（-irr）時(shí)無細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性試驗(yàn)所使用的濃度已達(dá)最高受試濃度（cmax）時(shí)，可按照下列公式計(jì)算pif： pifcmax（-irr）/ ic 50 （+irr） 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：如果只獲得一個(gè)"pif'，那么任何pif 1的值都能提示"有潛在光毒性'。 3受試物在最高濃度時(shí)仍未顯示任何細(xì)胞毒性，用"pif*1'表示，提示"無潛在光毒

15、性'。 （二）確定以平均光效應(yīng)（mpe值）為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型 通過在濃度網(wǎng)格上比較有光照（+irr）和無光照（-irr）兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線（i1，.，n）可得到平均光效應(yīng)（mpe），細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線的染毒濃度需在有光照（+irr）和無光照（-irr）試驗(yàn)共有的濃度范圍內(nèi)選擇。濃度ci的光效應(yīng)（pei）等于濃度效應(yīng)（cei）和反應(yīng)效應(yīng)（rei）的乘積。使用專門的軟件"photo32或更高版本'求得平均光效應(yīng)（mpe），建立以平均光效應(yīng)（mpe）為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型。 通過將mpe與臨界閾值mpec比較，預(yù)測(cè)化學(xué)物潛在光毒性的預(yù)測(cè)模型。 閾值mpec0.1

16、 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)： 如果mpe0.1：預(yù)測(cè)無潛在光毒性； 如果mpe0.15：預(yù)測(cè)有潛在光毒性。 如果mpe介于0.10.15之間，需進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如果mpe仍介于0.10.15之間，預(yù)測(cè)有潛在光毒性。 附錄 a nru pt 試驗(yàn)流程圖 時(shí)間 步驟 0 小時(shí) 接種 96 孔平板：110 4 個(gè)細(xì)胞/孔培養(yǎng)（37、5%7.5%co 2 、24h）。 24 小時(shí) 去除培養(yǎng)液，用 150l ebss/pbs 輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。 24 小時(shí) 分別用 100l 8 種不同濃度的受試物處理細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞 1h（37、5%7.5%co 2 ）。 25 小時(shí) 光毒性：室溫下暴露于有光照（+irr）（1.7m

17、w/cm 2 ）50 分鐘（即 5j/cm 2 ） 細(xì)胞毒性：室溫下將另一個(gè)平板置于黑暗環(huán)境 50 分鐘。 25 小時(shí) 50 分鐘 去除受試溶液，用 150l ebss 或 pbs 仔細(xì)沖洗細(xì)胞兩次，再用培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞（37、5%7.5%co 2 、18h22h 過夜）。 48 小時(shí) 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；去除培養(yǎng)液，用 150l ebss 或 pbs 沖洗細(xì)胞一次或兩次，加入 100l 含 50g/ml 中性紅的培養(yǎng)液培養(yǎng)（37、5%7.5%co 2 、3h）。 51 小時(shí) 去除中性紅培養(yǎng)液，用 150l ebss 或 pbs 沖洗細(xì)胞一次或兩次，加入150l 中性紅解吸附溶液。 51

18、 小時(shí) 震蕩平板 10 分鐘。 51 小時(shí) 10 分鐘 檢測(cè)在 540nm 波長(zhǎng)下細(xì)胞對(duì)中性紅的吸收情況（反映細(xì)胞活性）。 附錄 b 96 孔板加樣示意圖 1建議使用如下式樣 96 孔板。如使用軟件 nru-pit 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，則必須按以下所示，準(zhǔn)確設(shè)計(jì) 96 孔板的加樣。 2鑒于在平板四周外圍孔可能發(fā)生蒸發(fā)作用，建議將四邊這些孔作為空白對(duì)照，以糾正可能出現(xiàn)的塑膠材料對(duì)中性紅吸收所造成的結(jié)果干擾。 396 孔的加樣示例如下： b b b b b b b b b b b b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b uc c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 uc b b b b b b b b b