泛素化蛋白檢測方法

1、泛素化蛋白檢測方法蛋白質(zhì)泛素化簡介蛋白質(zhì)泛素化修飾過程在人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中起到了關(guān)鍵性的作用. 與 磷酸化修飾過程一樣,泛素化修飾過程也是一種可逆的共價修飾過程, 它能夠調(diào) 節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細胞內(nèi)定位等情況.泛素蛋白是一個由76個氨基酸殘基組成的非常保守的多肽,它能在E1、E2、 E3酶等一系列酶促反響催化下與細胞內(nèi)靶蛋白上的一個或多個賴氨酸殘基發(fā)生 共價連接.泛素蛋白本身也含有7個賴氨酸殘基,因此它們之間也可以通過這些 位點互相連接,形成多泛素蛋白鏈polyubiquitin chain.目前研究顯示,如 果多泛素蛋白鏈與被修飾蛋白上的第 48位賴氨酸殘基相連,會介

2、導靶蛋白進入 蛋白酶體而被降解；如果與被修飾蛋白上其它位點,比方第63位賴氨酸殘基相連,那么靶蛋白可以發(fā)揮信號通路功能而不會被降解.與磷酸化修飾途徑一樣,泛素化修飾途徑也是可逆的,即可以通過去泛素化 酶DUB將泛素蛋白修飾物去除掉.靶蛋白經(jīng)泛素化途徑修飾之后,連接在靶 蛋白上的泛素蛋白單體或多聚體可以被各種泛素蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域UBD所識別和結(jié)合.人類蛋白質(zhì)組中含有兩種 E1酶、50種E2酶、600種E3酶、90種DUB 酶和20種UBD這說明泛素修飾途徑在細胞調(diào)才$中起到了多么重要的作用.E3酶是泛素修飾途徑中決定底物特異性的關(guān)鍵酶,它可以分為兩大類,即含有HECT 結(jié)構(gòu)域的E3酶和其它含有RI

3、NG結(jié)構(gòu)域或RING樣結(jié)構(gòu)域比方U-box或PH印 構(gòu)域的E3酶.這兩種E3酶都在免疫調(diào)控過程中起到了關(guān)鍵性的作用.蛋白質(zhì)泛素化的檢測方法研究蛋白質(zhì)的泛素化首先需要明確的三個根本點：哪些蛋白發(fā)生了泛素化； 發(fā)生了泛素化的蛋白質(zhì),具體是哪個位點的賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化；進行定量.明確了上述幾點后,進一步需要弄清楚的是,我們感興趣的泛素化蛋白,是 如何發(fā)生泛素化的,影響這一泛素化過程的關(guān)鍵分子是什么？或者說這一過程中 的E3酶是什么？然后需要研究的是,這一蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化之后可以產(chǎn)生那些分子效應？對下游的信號通路有什么影響？研究上述內(nèi)容的實驗方法和實驗流程：方法一： western blot an

4、d strip通過WB僉測所有發(fā)生泛素化的蛋白條帶,拍照后,將膜 strip o然后與特 定蛋白的抗體和特定泛素化位點的抗體反響,顯色拍照.通過陽性條帶的 比照來初步判斷某一特定蛋白的特定位點發(fā)生了泛素化.【具體實驗流程附后】方法二： western blot and immunoprecipitations通過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結(jié)合的蛋白別離出來.別離 出來的蛋白再進行SDSt泳和western blot分析.【具體實驗流程附后】. 這一方法可以明確具體哪個蛋白的哪個賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化修飾.方法三：in vitro ubiquitination assay將要研究的目的

5、基因轉(zhuǎn)染293細胞,使其大量表達.24h后提取并別離目的 蛋白.在體外反響buffer中將我們要研究的蛋白A 被泛素化的那個蛋白 與 UBE1 UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex , HA-ubiquitin 以及我 們要研究的蛋白B 引起蛋白A泛素化的蛋白,共同進行孵育.將孵育后 的產(chǎn)物進行IP和W盼析.【具體實驗流程附后】.這一方法可以明確引起 哪個蛋白是引起某蛋白發(fā)生泛素化修飾的E3連接酶.方法四：in vitro ubiquitin-binding assay將我們要研究的蛋白被泛素化的蛋白基因轉(zhuǎn)染293細胞,大量表達后提純.或者直接提取內(nèi)源性蛋白.在

6、體外與 K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育,然后通過SDS電泳并用泛素化抗體進行檢測.這一方 法可以明確要研究的蛋白哪個賴氨酸殘基容易發(fā)生泛素化.方法一：WB strip實驗流程提取組織/細胞的總蛋白口使用總泛素化抗體檢測所有發(fā)生了泛素化的蛋白此時可以觀察到發(fā)生了泛素化的蛋白主要分布在哪些分子量區(qū)間用特定蛋白的抗體與膜反響顯色用Ub K63抗體與膜反響顯色Merge如果總的泛素化蛋白的條帶,與特定蛋白的條帶,以 及K63位點泛素化條帶發(fā)生了重合,此時可以初步推測,特定蛋白的第 63位賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化方法二： Western blot and immunoprecipitations提取組織/細胞總蛋白用瓊脂糖珠或磁珠包被的特異蛋白抗體,將與該蛋白結(jié)合的所有蛋白別離出來口SDS電泳JJ用泛素化抗體進行反響Stripping the口用特異抗體進行反響方法三：in vitro ubiquitination assay將要研究的蛋白基因轉(zhuǎn)染293細胞使其大量表達提取蛋白,通過免疫共沉淀方法別離目的蛋白將可能發(fā)生相互作用的兩種蛋白與UB