中分子總量測定及臨床意義（國建琴）05－7

1、 廊坊市愛爾血液凈化器材廠 國建琴 中分子總量測定及臨床意義中分子總量測定及臨床意義中分子檢測中分子檢測n檢測方法采用第一軍醫(yī)大學改進的檢測方法采用第一軍醫(yī)大學改進的氏紫外吸收法。主要是測血漿氏紫外吸收法。主要是測血漿MMSMMS總量，而不考慮總量，而不考慮MMSMMS的組分細節(jié)，操作簡單、微量、快速，可以在臨的組分細節(jié)，操作簡單、微量、快速，可以在臨床上廣泛應用。用于監(jiān)測體內(nèi)中分子的含量，也可床上廣泛應用。用于監(jiān)測體內(nèi)中分子的含量，也可以觀察血液灌流前后血漿以觀察血液灌流前后血漿MMSMMS的清除率。的清除率。肖應慶教授來我廠指導中分子檢測肖應慶教授來我廠指導中分子檢測 指存在于體液中分子量

2、在指存在于體液中分子量在30030050005000DaltonsDaltons之間的一類具有毒性作用的中等分子量的物質(zhì)之間的一類具有毒性作用的中等分子量的物質(zhì)（Middle Molecular Substance MMSMiddle Molecular Substance MMS）, ,簡稱簡稱中分子。中分子。 在在7070年代，年代，BabbBabb等提出了中分子物質(zhì)假等提出了中分子物質(zhì)假說，提出尿毒癥中毒本源性物質(zhì)是中分子，說，提出尿毒癥中毒本源性物質(zhì)是中分子，而不是傳統(tǒng)中認為的血中尿素、肌酐、尿而不是傳統(tǒng)中認為的血中尿素、肌酐、尿酸等小分子物質(zhì)的含量。酸等小分子物質(zhì)的含量。 n其后的研

3、究證明其后的研究證明MMSMMS確是尿毒癥患者體內(nèi)確是尿毒癥患者體內(nèi)重要的病源物質(zhì)。重要的病源物質(zhì)。n目前的研究表明：尿毒癥患者體內(nèi)至少目前的研究表明：尿毒癥患者體內(nèi)至少有有200200多種物質(zhì)的濃度高于正常人。按其多種物質(zhì)的濃度高于正常人。按其分子量可分為分子量可分為3 3大類：小分子水溶性毒素、大類：小分子水溶性毒素、中大分子類毒素和能與蛋白質(zhì)結合的毒中大分子類毒素和能與蛋白質(zhì)結合的毒素。素。n現(xiàn)在科學的發(fā)展已進入了組分分析階段，現(xiàn)在科學的發(fā)展已進入了組分分析階段，像瘦素、像瘦素、PTHPTH、TNF-aTNF-a、IL-6IL-6等等2222種中分種中分子毒素能被準確定量分析，但檢測費用

4、子毒素能被準確定量分析，但檢測費用昂貴。昂貴。n目前臨床開展總量測定具有實際指導意目前臨床開展總量測定具有實際指導意義。義。取干凈的取干凈的7512 mm（內(nèi)徑）試管，按下表操作：內(nèi)徑）試管，按下表操作： 血血 漿漿 0.1 ml 0.500 mol/L HClO4 0.2 ml 振勻，按振勻，按“沉淀溫度沉淀溫度時間曲線時間曲線”放置一定時間放置一定時間 蒸蒸 餾餾 水水 1.1 ml搖勻，搖勻，28003200g離心離心10分鐘分鐘 取取 上上 清清 1.0 ml 蒸蒸 餾餾 水水 2.0 ml混勻，在波長混勻，在波長254 nm處，光徑處，光徑cm，用蒸餾水作空白用蒸餾水作空白調(diào)零，測定

5、吸光度。調(diào)零，測定吸光度。血漿中分子物質(zhì)總量測定操作步驟血漿中分子物質(zhì)總量測定操作步驟檢驗人員使用微量加樣器在試管里加樣 離心機 檢驗人員使用紫外分光光度計測中分子含量離心機轉(zhuǎn)速與離心力的列線圖離心機轉(zhuǎn)速與離心力的列線圖 測定結果用測定結果用“條件單位（條件單位（u u）”表示。完全按上表示。完全按上述條件進行操作，以最后測得的吸光度述條件進行操作，以最后測得的吸光度1 1A A為為1 1個個條件單位。結果報告，標本以分升（條件單位。結果報告，標本以分升（dldl）為單位，為單位， 即即“u/dl”u/dl”。假設測得一標本的吸光度為假設測得一標本的吸光度為0.2360.236，則表示為則表示

6、為“236“236u/dl”u/dl”。因為測定時實際取用標因為測定時實際取用標本本0.1 0.1 mlml，現(xiàn)用現(xiàn)用“dl”dl”來表示，擴大了來表示，擴大了10001000倍。倍。所以測得的吸光度相應也要擴大所以測得的吸光度相應也要擴大10001000倍。倍。 通過加酸沉淀蛋白，離心除去絕大部分通過加酸沉淀蛋白，離心除去絕大部分大分子物質(zhì)（血漿蛋白）；測定中分子物質(zhì)大分子物質(zhì)（血漿蛋白）；測定中分子物質(zhì)的吸光度時的吸光度時 ，選擇合適的吸收波長（，選擇合適的吸收波長（254 254 nmnm），），盡量避開大、小分子物質(zhì)（酸溶性蛋盡量避開大、小分子物質(zhì)（酸溶性蛋白、肌酐、尿素等）的干擾。白

7、、肌酐、尿素等）的干擾。 測測 定定 原原 理理尿毒癥患者血漿HClO4沉淀上清液健康人血漿HClO4沉淀上清液Sephadex G-25 微量柱分離血漿中分子層析圖譜微量柱分離血漿中分子層析圖譜 是為在臨床推廣應用是為在臨床推廣應用 “ “中分子物質(zhì)含中分子物質(zhì)含量量” ” 這一指標。開展本法無需高檔的儀器這一指標。開展本法無需高檔的儀器和特殊的試劑，經(jīng)濟快速，操作方法簡單，和特殊的試劑，經(jīng)濟快速，操作方法簡單，標本用量少，出結果快，適合臨床需要；基標本用量少，出結果快，適合臨床需要；基層廠礦、部隊醫(yī)院和鄉(xiāng)、鎮(zhèn)醫(yī)院都可以開展。層廠礦、部隊醫(yī)院和鄉(xiāng)、鎮(zhèn)醫(yī)院都可以開展。 設設 計計 思思 想想

8、為為保證血漿中分子物質(zhì)（保證血漿中分子物質(zhì)（MMSMMS）總量測定結果的總量測定結果的一致性，現(xiàn)將操作方法規(guī)范如下：一致性，現(xiàn)將操作方法規(guī)范如下：1. 1. 測定樣品一律使用測定樣品一律使用肝素或肝素鈉抗凝血漿肝素或肝素鈉抗凝血漿?？?。抗凝管制備：用微量進樣器預加臨床用肝素或肝素鈉凝管制備：用微量進樣器預加臨床用肝素或肝素鈉注射液（注射液（1250012500u/2mlu/2ml）約約 10 10 lmllml。血漿中分子物質(zhì)血漿中分子物質(zhì)總量測定方法規(guī)范化要求總量測定方法規(guī)范化要求2. 2. 一般采空腹靜脈血，一般采空腹靜脈血，離心（離心（15001500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分） 1010minmi

9、n分離血漿，在分離血漿，在2 2小時內(nèi)進行測定；如不能及小時內(nèi)進行測定；如不能及時測定，必須將分離血漿移于另一干凈試管或帶時測定，必須將分離血漿移于另一干凈試管或帶蓋小塑料離心管中蓋小塑料離心管中 ，密封保存。，密封保存。 如在一周內(nèi)測如在一周內(nèi)測定可置定可置44冰箱；如超過一周測定，必須冰箱；如超過一周測定，必須保存在保存在00以下以下。在。在20 20 或更低溫度下，保存可達數(shù)或更低溫度下，保存可達數(shù)月至幾年。冰凍血漿復溶后一般出現(xiàn)絮狀物，不月至幾年。冰凍血漿復溶后一般出現(xiàn)絮狀物，不能離心或過濾除去沉淀，但在測定前必須充分振能離心或過濾除去沉淀，但在測定前必須充分振蕩混合均勻。蕩混合均勻。

10、3. 3. 加樣器必須經(jīng)常校正，加樣器必須經(jīng)常校正， 保證加樣量準確為保證加樣量準確為100 100 l l。血漿樣品一定要加到管底血漿樣品一定要加到管底, ,切勿沾附于試管壁。切勿沾附于試管壁。測定用試管大小以測定用試管大小以757512 12 mmmm（內(nèi)徑）為宜。內(nèi)徑）為宜。4. 4. 沉淀血漿蛋白用試劑，廠家及批號不限，但使沉淀血漿蛋白用試劑，廠家及批號不限，但使用的濃度一定要準確用的濃度一定要準確校正至校正至0.500 0.500 mol/Lmol/L（校正時校正時必須稀釋至必須稀釋至0.1 0.1 mol/Lmol/L左右進行）。左右進行）。 5. 5. 蛋白沉淀劑的加量（蛋白沉淀

11、劑的加量（200 200 l l）也必須準確。也必須準確?？蓮臏y定管的中部或更低靠管壁加入，振蕩時不可從測定管的中部或更低靠管壁加入，振蕩時不要使樣品沾附管壁高于要使樣品沾附管壁高于1 1 cmcm。 6. 6. 關于沉淀放置時間，按關于沉淀放置時間，按“沉淀溫度沉淀溫度時時間曲線間曲線”選擇，選擇， 計時務必精確到計時務必精確到5 5秒以內(nèi)。從加秒以內(nèi)。從加入蛋白沉淀劑時便開始計時，入蛋白沉淀劑時便開始計時， 而不是從振蕩結束而不是從振蕩結束時開始計時。時開始計時。 測定測定環(huán)境溫度應在環(huán)境溫度應在1717以上，以上， 2929以下，以下，低于低于1717時，時，“沉淀溫度沉淀溫度時間曲時間

12、曲線線”已不再適用。已不再適用。 7. 7. 加入加入1.1 1.1 mlml水之后，振蕩不能太劇烈，只要見到水之后，振蕩不能太劇烈，只要見到管底沉淀懸浮起來即可。如振蕩過于劇烈，可使測定管底沉淀懸浮起來即可。如振蕩過于劇烈，可使測定結果偏高；結果偏高； 反之，振蕩輕微，測定結果又會偏低。反之，振蕩輕微，測定結果又會偏低。8. 8. 及時離心，離心時間為及時離心，離心時間為1010 1 1分鐘。離心機的廠家分鐘。離心機的廠家及型號不限，離心力控制在及型號不限，離心力控制在 2500 25003500 3500 g g 范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。離心力的計算依據(jù)離心半徑離心力的計算依據(jù)離心半徑( (cm)

13、cm)和準確的離心轉(zhuǎn)速和準確的離心轉(zhuǎn)速( (r r min min）參數(shù)。離心半徑的正確測量是從離心轉(zhuǎn)軸中心參數(shù)。離心半徑的正確測量是從離心轉(zhuǎn)軸中心至離心狀態(tài)離心管底試樣的水平距離。至離心狀態(tài)離心管底試樣的水平距離。 9. 9. 吸取上清吸取上清1.0 1.0 ml , ml , 計量要準確，并不能混計量要準確，并不能混有沉淀。有沉淀。 10. 10. 測定用紫外分光光度計，測定用紫外分光光度計， 廠家及型號不限，廠家及型號不限，波長要校準至波長要校準至254254 1 1nmnm。使用數(shù)碼顯示的紫外分光使用數(shù)碼顯示的紫外分光光度計，如光度計，如752752型，還需校正透光率型，還需校正透光率

14、( (T T）與吸光度與吸光度（A A）的對數(shù)轉(zhuǎn)換斜率（儀器本身能自動校正的除的對數(shù)轉(zhuǎn)換斜率（儀器本身能自動校正的除外外) )。此外，光源燈發(fā)出的紫外光能量和光電管的。此外，光源燈發(fā)出的紫外光能量和光電管的靈敏度以及儀器的其他性能，靈敏度以及儀器的其他性能， 都是可能影響測定都是可能影響測定結果的因素。結果的因素。 一般來說，只要是出廠合格的產(chǎn)品，在使用過程一般來說，只要是出廠合格的產(chǎn)品，在使用過程中能按操作規(guī)程正確操作，中能按操作規(guī)程正確操作， 平時注意儀器的維護保平時注意儀器的維護保養(yǎng)，養(yǎng)， 再加上定期校正、檢修，就可避免由于測定儀再加上定期校正、檢修，就可避免由于測定儀器帶來的誤差。器帶

15、來的誤差。 11. 11. 注意石英比色杯之間透光度的一致性，配套后注意石英比色杯之間透光度的一致性，配套后就不要與其他石英比色杯串用。就不要與其他石英比色杯串用。 經(jīng)常保持比色杯的經(jīng)常保持比色杯的清潔干凈，用后及時沖洗，置無塵干燥處保存。清潔干凈，用后及時沖洗，置無塵干燥處保存。 1. 1. 測定對象為經(jīng)體檢確定是健康人，不宜用測定對象為經(jīng)體檢確定是健康人，不宜用獻血員樣品；獻血員樣品； 2. 2. 一般采空腹靜脈血，不能有明顯溶血；年一般采空腹靜脈血，不能有明顯溶血；年齡分組，以齡分組，以1010歲為一個年齡組（歲為一個年齡組（1010歲以下，歲以下，11112020歲，歲，6161707

16、0歲，歲，7171歲以上）；歲以上）； 3. 3. 性別分組，男女約各占一半。性別分組，男女約各占一半。新開展中分子總量測定的單位，宜先測定部分新開展中分子總量測定的單位，宜先測定部分正常值，正常值， 以檢驗對測定方法的掌握情況，而后再以檢驗對測定方法的掌握情況，而后再檢測病例標本。檢測病例標本。 附附1 1：正常值測定要求：正常值測定要求1. 7521. 752型紫外光柵分光光度計型紫外光柵分光光度計2. 2. LD5-2ALD5-2A低速離心機（約低速離心機（約50005000元元 / / 臺）臺）3. 3. 旋渦混合器（約旋渦混合器（約300300元元 / / 臺）臺）4. 4. 微量連

17、續(xù)可調(diào)移液器：微量連續(xù)可調(diào)移液器：QYQ1000 1QYQ1000 1支，支，QYQ100 1QYQ100 1支支5. 5. 可調(diào)定量加液器可調(diào)定量加液器 5 5 ml 2ml 2只，只，1 1 ml 1ml 1只只6. 756. 7512 12 mm ( mm ( 內(nèi)徑內(nèi)徑 ) )玻璃試管或一次性塑料試管玻璃試管或一次性塑料試管7. 7. 定時鐘定時鐘8. 8. 溫度計溫度計附附2 2：中分子物質(zhì)總量測定儀器、器材：中分子物質(zhì)總量測定儀器、器材v疾病診斷及其病情嚴重的估計 MMS總量改變可作為某些疾病診斷的指標之一，如尿毒癥，肝性昏迷及急性燒傷毒血癥等已經(jīng)得到證實v病程變化的動態(tài)指標 因為M

18、MS總量水平的增高與某些疾病病情嚴重程度密切相關,可以為臨床醫(yī)生提供客觀指標。 中分子（中分子（MMSMMS）總量測定臨床意義：總量測定臨床意義：v血液凈化效果的觀察 長期透析患者，定期進行透析治療，雖然可以清除一些小分子毒性物質(zhì)尿素、肌酐及尿酸，改善臨床癥狀，但對中分子物質(zhì)（MMS）則較難透出，可以用相對特異吸附的樹脂吸附柱進行灌流，臨床上以此指標觀察MMS的清除效果。 中分子（中分子（MMSMMS）總量測定臨床意義：總量測定臨床意義：廊坊地區(qū)正常人群血漿廊坊地區(qū)正常人群血漿MMS含量測定含量測定1 1、臨床資料：調(diào)查對象為體檢健康的正常人、臨床資料：調(diào)查對象為體檢健康的正常人105105例

19、，年齡為例，年齡為 17 175454歲，平均（歲，平均（25257 7）歲；男性）歲；男性4949例，女性例，女性5656例。例。 2 2、取清晨空腹血樣、取清晨空腹血樣2 2mlml，加入肝素抗凝管中，離心后及時分離加入肝素抗凝管中，離心后及時分離 血漿，取樣測定。血漿，取樣測定。 3 3、廊坊市區(qū)、廊坊市區(qū)105105例健康成人血漿例健康成人血漿MMSMMS含量正常值為含量正常值為2402402424u/dlu/dl， 其中男性其中男性MMSMMS為為2442442424u/dlu/dl，女性女性MMSMMS為為2372372424u/dlu/dl，性別性別 之間無顯著性差異（之間無顯著

20、性差異（P0.05P0.05），），其中不同年齡組及同一年齡其中不同年齡組及同一年齡 組內(nèi)男女性別之間均無顯著性差異（組內(nèi)男女性別之間均無顯著性差異（P0.05P0.05） 年齡組（歲）年齡組（歲）男性男性女性女性合計合計176239208239191723919202725024412392368244243026235257219322323128合計合計4924424562372410524024 105105例血漿例血漿MMSMMS測定值（測定值（u/dlu/dl， X XSDSD） 血漿血漿MMSMMS（u/dlu/dl）男性男性女性女性合計合計1801802002002202202

21、40240260260280280合計合計3 34 41111141417170 049495 58 8191914149 91 156568 812123030282826261 1105105105105例血漿例血漿MMSMMS測定值頻數(shù)分布測定值頻數(shù)分布 上表可以看出，其頻數(shù)呈正態(tài)分布。地區(qū)地區(qū)測定結果測定結果u/dl（XSD）地區(qū)地區(qū)測定結果測定結果u/dl（XSD）沈陽地區(qū)沈陽地區(qū)2342222長春地區(qū)長春地區(qū)2251515遼寧盤錦遼寧盤錦2272828大連地區(qū)大連地區(qū)2261919鞍山地區(qū)鞍山地區(qū)2372727北京地區(qū)北京地區(qū)2273232西安地區(qū)西安地區(qū)2192424蘭州地區(qū)蘭州

22、地區(qū)2242424山東淄博山東淄博2203636豫北地區(qū)豫北地區(qū)2121919鄭州地區(qū)鄭州地區(qū)2182323湘中地區(qū)湘中地區(qū)2352020杭州地區(qū)杭州地區(qū)2251111廣西玉林廣西玉林2182121廣西南寧廣西南寧2252525廣東肇慶廣東肇慶2371616北京地區(qū)北京地區(qū)2321616天津地區(qū)天津地區(qū)2242626大連地區(qū)大連地區(qū)2282727丹東地區(qū)丹東地區(qū)2142626河南平輿河南平輿2201818昆明地區(qū)昆明地區(qū)2192626廣東梅縣廣東梅縣2241818烏魯木齊烏魯木齊2302727遼陽地區(qū)遼陽地區(qū)2221414廊坊地區(qū)廊坊地區(qū)2402424部分地區(qū)健康人血漿中分子物質(zhì)含量部分地區(qū)健

23、康人血漿中分子物質(zhì)含量 由于受各種因素的影響，各地之間的血漿MMS總量有所差別，因此，須建立本地區(qū)的正常值，可以為臨床提供較為可靠的檢測診斷標準。實驗表明，廊坊市區(qū)健康人群血漿MMS正常值為24024u/dl。本實驗測定的結果與崔廣山等人測定北京地區(qū)血漿中分子的含量（23216u/dl）相比，差別不大，說明本實驗結果可靠，可作為廊坊市區(qū)臨床正常指標參考范圍。 臨床應用效果臨床應用效果天津武警醫(yī)學院附屬醫(yī)院天津武警醫(yī)學院附屬醫(yī)院n臨床應用ZX-150聯(lián)合HD對16例長期透析患者進行治療，MMS下降率為21.4，其中一位患者劉某某，第一次HP+HD后，MMS由454u/dl下降到336u/dl，一

24、周后再次行HP+HD， MMS由360u/dl下降到261u/dl，基本接近正常水平，且患者其它癥狀改善明顯。天津塘沽醫(yī)院天津塘沽醫(yī)院n對35例透析患者取透析前血樣，經(jīng)檢測平均MMSu/dl，最高為569u/dl，最低為309u/dl。一次性使用血液灌流器一次性使用血液灌流器臨床應用注意事項臨床應用注意事項 血液灌流臨床應用有三大不良反應：凝血、血壓下降、致熱反應，因此必須由有血液灌流經(jīng)驗的醫(yī)生使用，使用前詳細閱讀使用說明書。灌流要點n1 防止凝血n2 防止血壓下降n3 防止過敏反應防凝血n血液灌流不同于血液透析血液灌流器吸附劑比表面積（1000m2/g)比一般透析膜(0.81.5m2)大得多

25、,故與血液接觸面也顯著增加，因此HP時的肝素量比普通透析要大。n灌流平順與否，抗凝十分重要，包括 1 患者全身肝素化 2 灌流器肝素化 3 體外循環(huán)時過程追加 灌流器的肝素化1、將灌流器與動脈管路連接時，動脈管路必須充滿的葡萄糖注射液或生理鹽水，防止空氣進入灌流器，引起排氣困難。2、先用500ml的葡萄糖注射液沖洗，避免吸附患者血糖。3、用1000ml肝素生理鹽水 (每500ml鹽水加20mg肝素) 沖洗，速度為100200ml/min，沖洗時，需用手輕拍及轉(zhuǎn)動吸附柱，主要是清除脫落的微粒，排除氣泡，同時觀察有無顆粒隨液體流出，如有，禁止使用。4、再用500ml生理鹽水（內(nèi)加100mg肝素）沖

26、洗至200ml時，將動靜脈管路連接閉路循環(huán)（200ml/min）不少于20min，以保證灌流器充分肝素化。若與透析串聯(lián)使用，將灌流器連接在透析器之前，一起閉路循環(huán)。 患者全身肝素化 首次劑量按mg/kgmg/kg體重。靜脈給肝素10min后，才能開始血液灌流系統(tǒng)的體外循環(huán)。 透析患者做HP+HD,必須在透析肝素化的基礎上增加肝素，首次肝素常用量1mg/kg，視患者自身情況酌情調(diào)整(監(jiān)測凝血活酶時間，一般WBPTT延長80)。 如條件允許，全身肝素化可選用低分子肝素抗凝（特別是透析患者宜采用低分子肝素抗凝），指患者全身肝素化用低分子，灌流器肝素化仍使用普通肝素，是否追加視情況。 灌流過程追加肝素 灌流開始20min時，一次追加肝素58mg，以后每半小時一