專(zhuān)題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

1、專(zhuān)題五 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題1 DNA的粗提取與鑒定課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷課題3 血紅蛋白的提取和分離課題1 DNA的粗提取與鑒定1、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路 （1） 選用一定的選用一定的_或或_方法分離具有方法分離具有 不不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。 （2） DNA的粗提取就是利用的粗提取就是利用DNA與與_、_和和_等在物理或化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取等在物理或化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。，去除其他成分。物理物理化學(xué)化學(xué)RNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂質(zhì)脂質(zhì)（1）利用）利用DNA的溶解性的溶解性 DNA的溶解度

2、的溶解度2、提取、提取DNA分子的基本原理分子的基本原理 DNA不不_酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則蛋白質(zhì)則_酒精。利用這一原理，可將酒精。利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。溶于溶于溶于溶于 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對(duì)蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對(duì)_沒(méi)有影響。沒(méi)有影響。 大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受_的高溫，而的高溫，而 DNA在在80以上才會(huì)變性。以上才會(huì)變性。 洗滌劑能夠瓦解洗滌劑能夠瓦解_，但對(duì)，但對(duì)_沒(méi)沒(méi) 有影響。有影響。溫度溫度洗滌劑洗滌劑DNA60-80細(xì)胞膜細(xì)胞膜DNA（2 2）利用）利用DNADNA和蛋白質(zhì)對(duì)酶、和

3、蛋白質(zhì)對(duì)酶、_和和_的耐受性不同的耐受性不同 （3）DNA的鑒定：的鑒定： DNA在沸水浴的條件下，遇在沸水浴的條件下，遇_反應(yīng)會(huì)反應(yīng)會(huì) 呈現(xiàn)呈現(xiàn)_二苯胺二苯胺藍(lán)色藍(lán)色本實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)中，要往雞血中加入抗凝劑要往雞血中加入抗凝劑(1)先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細(xì)胞先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細(xì)胞(2)在雞血細(xì)胞中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪在雞血細(xì)胞中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪 拌，過(guò)濾后收集濾液即可拌，過(guò)濾后收集濾液即可實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：1 1、雞血細(xì)胞液（、雞血細(xì)胞液（510ml510ml）；）；2 2、體積分?jǐn)?shù)為、體積分?jǐn)?shù)為95%95%的冷酒精溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰的冷酒精

4、溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻箱內(nèi)冷卻24h24h）；）；3 3、蒸餾水；、蒸餾水；4 4、質(zhì)量濃度為、質(zhì)量濃度為0.10.1g/ml的檸的檸檬酸鈉溶液（抗凝劑）檬酸鈉溶液（抗凝劑）5 5、物質(zhì)的量濃度分別為、物質(zhì)的量濃度分別為2mol/L2mol/L和和0 0015mol/L015mol/L的的NaClNaCl溶液；溶液；6 6、二苯胺試劑、二苯胺試劑攪拌攪拌目的目的第一次第一次 攪拌加蒸餾水的雞血細(xì)胞液，加速細(xì)胞破裂攪拌加蒸餾水的雞血細(xì)胞液，加速細(xì)胞破裂第二次第二次 攪拌含攪拌含DNADNA的高濃度鹽溶液，加速的高濃度鹽溶液，加速 _第三次第三次 攪拌加蒸餾水的攪拌加蒸餾水的NaClNaCl溶

5、液，溶液， _第四次第四次 攪拌含攪拌含DNADNA的高濃度鹽溶液，加速的高濃度鹽溶液，加速 _第五次第五次 攪拌含攪拌含DNADNA的酒精溶液，提取的酒精溶液，提取 _第六次第六次 攪拌含攪拌含DNADNA白色絲狀物的鹽溶液，加速白色絲狀物的鹽溶液，加速 _DNADNA的溶解的溶解均勻稀釋以析出更多均勻稀釋以析出更多DNADNADNADNA的溶解的溶解含雜質(zhì)較少的含雜質(zhì)較少的DNADNADNADNA的溶解的溶解NoImage一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類(lèi)構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分糖類(lèi)構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠

6、就叫分子篩）子篩） 根據(jù)根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的的大小分離蛋白質(zhì)的 有效方法有效方法，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作 用用來(lái)進(jìn)行分離。來(lái)進(jìn)行分離。 相對(duì)分相對(duì)分子質(zhì)量子質(zhì)量直徑大小直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度速度運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)路程路程洗脫洗脫次序次序大大_凝膠顆粒凝膠顆?？障吨睆?，被空隙直徑，被排阻在排阻在_垂直向下垂直向下移動(dòng)移動(dòng)_較短較短先從凝先從凝膠柱洗膠柱洗脫出來(lái)脫出來(lái)小小_凝膠顆粒凝膠顆?？障吨睆剑煽障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)以進(jìn)入顆粒內(nèi)部部垂直向下垂直向下移動(dòng)，無(wú)移動(dòng)，無(wú)規(guī)則擴(kuò)散規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠進(jìn)入凝膠顆粒顆粒_較長(zhǎng)較長(zhǎng)后從

7、凝后從凝膠柱洗膠柱洗脫出來(lái)脫出來(lái)洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液， 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。外界的酸或堿外界的酸或堿pHpH值值1-21-2比例比例在不同在不同pHpH范圍內(nèi)范圍內(nèi)在同一電場(chǎng)下，由于各種分子在同一電場(chǎng)下，由于各種分子帶電性質(zhì)帶電性質(zhì)（正電（正電荷或負(fù)電荷）的差異及分子本身荷或負(fù)電荷）的差異及分子本身大小、形狀大小、形狀，而使帶電粒子產(chǎn)生不同的，而使帶電粒子產(chǎn)生不同的遷移速度遷移速度。（2 2）原理：）原理：二二 、粗提取血紅蛋白、粗提取血紅蛋白蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：血血液液血

8、漿血漿血細(xì)胞血細(xì)胞白細(xì)胞白細(xì)胞血小板血小板紅細(xì)胞紅細(xì)胞（最多）（最多）血紅血紅蛋白蛋白兩個(gè)兩個(gè)a a肽鏈肽鏈兩個(gè)兩個(gè)一肽鏈肽鏈樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定(1)目的：去除目的：去除_1、紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白雜質(zhì)蛋白(2)方法：方法：采集血樣：為防止血液凝固，需在采血器中加入采集血樣：為防止血液凝固，需在采血器中加入 抗抗凝血?jiǎng)幟仕徕c凝血?jiǎng)幟仕徕c 低速短時(shí)間離心低速短時(shí)間離心：500 r/min，離心，離心2min，這樣做，這樣做的目的是防止紅細(xì)胞與白細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的目的是防止紅細(xì)胞與白細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離效果效果 吸去血漿吸去血漿：用膠頭吸管吸去上層黃

9、色血漿：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿 生理鹽水洗滌：向盛有暗紅色紅細(xì)胞液體的燒杯中加入生理鹽水洗滌：向盛有暗紅色紅細(xì)胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10min 低速短時(shí)間離心低速短時(shí)間離心 重復(fù)重復(fù)步驟步驟3次次：直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)：直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復(fù)洗滌胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復(fù)洗滌（1）方法：加）方法：加_到原血液體積，再加到原血液體積，再加40體體 積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢璺e的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘。分鐘。（2）目的：使紅細(xì)胞吸水）目的：使紅細(xì)胞吸水_，血紅蛋白釋放，血紅蛋

10、白釋放出來(lái)。出來(lái)。漲破漲破蒸餾水蒸餾水2、血紅蛋白的釋放（3）原理：滲透作用）原理：滲透作用3、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以管內(nèi)，以2000r/min的速度離心的速度離心10 min ，試管中的溶，試管中的溶液分為液分為4層層:第第1 1層層 無(wú)色透明甲苯層無(wú)色透明甲苯層第第2 2層層 脂溶性物質(zhì)沉淀層，白色薄層固體脂溶性物質(zhì)沉淀層，白色薄層固體第第3 3層層 紅色透明液體（紅色透明液體（血紅蛋白水溶液血紅蛋白水溶液） 第第4 4層層 其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀4、透析(1)原理：原理：_能使小分子自由進(jìn)出，能使小

11、分子自由進(jìn)出，而將而將大分子保留在袋內(nèi)。大分子保留在袋內(nèi)。(2)過(guò)程：取過(guò)程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透的血紅蛋白溶液裝入透析袋析袋中，將透析袋放入盛有中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃的物質(zhì)的量濃度為度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中的磷酸緩沖液中(pH為為7.0)，透，透析析12 h。透析袋透析袋三、純化蛋白質(zhì)三、純化蛋白質(zhì)1、凝膠色譜柱的制作、凝膠色譜柱的制作取長(zhǎng)取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管， 兩端需用砂紙磨平。兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安裝移液管頭部安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng)，再用覆蓋尼龍網(wǎng)，再用

12、 100目尼龍紗將橡皮塞上部包好。目尼龍紗將橡皮塞上部包好。頂塞的制作：頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞插入安裝了玻璃管的橡皮塞組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。2、凝膠色譜柱的裝填(1)(1)計(jì)算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需計(jì)算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需 凝膠量凝膠量(2)(2)凝膠凝膠溶脹溶脹：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配 成凝膠懸液成凝膠懸液(3)(3)固定固定：將色譜柱垂直固定在支架上：將色譜柱垂直固定在支架上(4)(4)裝填裝填：將凝膠懸液一次性裝填入色譜：將凝膠懸液一次性裝填入色譜 柱內(nèi)柱內(nèi)(5)(5

13、)洗滌平衡洗滌平衡：用：用20 mmol/L20 mmol/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH(pH7.0)7.0)洗滌平衡凝膠洗滌平衡凝膠12 h12 h，使凝膠裝填緊，使凝膠裝填緊密密3、樣品加入與洗脫a a、加樣前、加樣前 打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)凝打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的膠面上的_緩慢緩慢下降到與下降到與_平齊，關(guān)平齊，關(guān)閉出口閉出口緩沖液緩沖液凝膠面凝膠面b b、加透析樣品、加透析樣品調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用吸管將滴加透析樣品：用吸管將1ml透析液的樣品加到色透析液的樣品加到色譜柱的頂端譜柱的頂端樣品滲入凝膠床：樣品滲入凝膠床：_在調(diào)整緩沖液面：關(guān)閉出口，小心加入在調(diào)整緩沖液面：關(guān)閉出口，小心加入20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度洗脫：打開(kāi)下端，用磷酸緩沖液洗脫洗脫：打開(kāi)下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待收集：待_接近色譜柱底端時(shí)，用接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出